甜菜碱对PSⅡ放氧中心结构的选择性保护

植物光系统Ⅱ( PS Ⅱ)放氧中心复合体主要包括跨类囊体膜的D1,D2多肽和暴露于水相的分子量分别为18,23,33ku的3个外周蛋白.高浓度盐等多种处理方法,都可使外周蛋白部分或全部脱落,进而影响水氧化放氧的关键机构——锰分子簇的正常运转.最近报道的三氯乙酸盐处理放氧中心复合体是一种使与放氧有关的外周蛋白依次脱落的新方法,其作用特点与分子的疏水性有明显的相关性.由于外周蛋白暴露于水相之中,容易遭受水分胁迫的影响,因而PSⅡ膜颗粒可成为植物水分胁迫研究的一个理想模型. 甜菜碱是一种较普遍存在于细菌及动植物中的渗透调节物质,在高盐条件下的组织中尤为常见.90年代以来,一些实验证明,甜菜碱可以保护PSⅡ颗粒,防止高浓度盐造成的外周蛋白脱落;研究还表明,甜菜碱可以稳定Mn簇的空间结构,维持在高盐环境中 PSⅡ颗粒的放氧活性.而高浓度甜菜碱本身不影响PSⅡ颗粒的放氧功能.本实验通过用NaCl、三氯乙酸钠(TCA)处理PSⅡ膜颗粒,比较两种处理时,甜菜碱稳定外周蛋白的作用有何异同,进一步研究甜菜碱稳定作用的本质.     

双半乳糖甘油脂存在下光系统Ⅱ核心复合物放氧反应的热变性

采用氧极谱技术、傅里外变换红外光谱(FT—IR)技术和凝胶电泳(SDS—PAGE)技术研究了双半乳糖寸油二酯(DGDG)对光系统Ⅱ核心复合物(PsⅡcc)放氧反应热稳定性的影响。结果表明，在DGDG存在下，PSⅡcc放氧活性的热变温度从40．0℃提高至43．0℃。5min的45．0℃恒温处理，会导致PSⅡcc的放氧活性完全丧失；而在DGDG存在下，PSⅡcc却仍然有16％的活性(以25．0℃时的为对照)。此外，PSⅡcc在38．0℃下处理1h，其放氧活性完全失活；而在同样条件下，PsⅡcc与DGDG的复合物却只失去了大约80％的活性(以零时间为对照)．结果分析表明，DGDG对PSⅡcc放氧反应的热变性具有调控作用，能抑制外周蛋白33kD从PSⅡcc上热致解离．     

光系统Ⅱ碳酸酐酶与放氧外周多肽及锰分子簇的关系

以菠菜ＰＳⅡ膜颗粒为材料,研究了ＰＳⅡ放氧复合体３个外周多肽及锰分子簇对ＰＳⅡ－ＣＡ的影响。实验结果可作为支持ＰＳⅡ放氧侧存在膜结合态ＣＡ的直接证据。外周多肽的存在对维持ＣＡ活性起着重要作用。去除锰簇后放氧活性受抑制但ＣＡ活性不受影响,表明ＣＡ的功能并不依赖于锰分子簇的存在,与放氧活性并不直接相关。     

低pH诱导光合放氧33 kD蛋白构象显著变化

33 kD蛋白分子是高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)放氧侧3个外周蛋白中的一个, 仅含1个色氨酸残基(W241). CD光谱与荧光谱的研究结果表明, 当溶液的pH由6.2降到2.5时, 33 kD蛋白的溶液构象发生明显变化, 无规卷曲增加, α-螺旋和转角比例降低. 这种变化对pH是可逆的. 低pH下再经NBS修饰, CD光谱特征不变，但200 nm处负峰的峰值降低，表明蛋白构象中的无规卷曲进一步增加. 同时, 33 kD蛋白的柔性降低, 构象变化变成对pH不可逆, 表明NBS修饰W241破坏了33 kD蛋白构象变化的可逆性. NBS修饰后的33 kD蛋白与PSⅡ的结合专一性与修饰前相比大大降低, 且不能提高重组后PSⅡ放氧活力. 这些结果表明低pH是诱导33 kD蛋白构象由适应光合放氧显著变化至失活的主要原因, 而不是NBS修饰. 结合33 kD蛋白与质子的特殊关系, 对低pH诱导的意义进行了讨论.     

Cl~-维持PSII锰复合物功能结构的实验证据

锰原子附着在植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心D_1和D_2蛋白上,构成锰蛋白复合物,在外周天线蛋白(47,43kD)、3种水溶性蛋白(33,23,17ku)、无机离子Ca~(2+)和Cl~-的辅助调节下,吸收光能,通过S_0→S_4态的循环,将水分解,形成分子氧.用氯化钠溶液清洗去除23,17ku水溶性蛋白后,水分解酶中锰原子极易被PD(Phenylenediamine,苯二胺)和HQ(Hydroquinone,氢醌)之类还原剂攻击,由Mn≥3+还原形成Mn~(2+)并释放出水分解酶,此过程伴随着水分解活性的相应降低.     

光系统Ⅱ反应中心电荷分离和能量传递的动力学研究

光合作用中最核心的步骤之一是在反应中心进行的原初反应,PSⅡ反应中心原初反应的机理研究已日益成为国际光合作用研究的焦点这一.1987年Nanba和Satoh首次分离纯化出PSⅡ反应中心D1/D2/Cyt b559复合物以来,国际上对PSⅡ反应中心的原初电荷分离(Charge separation)、电荷重组(Charge recombination)和能量传递过程的动力学性质采用时间分辨荧光光谱和吸收光谱及烧孔谱(Hole-burning Spectroscopy)等技术进行研究,已取得一些有意义的结果.但是,由于PSⅡ反应中心中色素分子的吸收光谱重叠严重,其吸收光谱在675nm处仅有一个吸收峰,无法选择性地激发原初电子供体P680,实验得到的数据比较复杂,不同实验室得到的动力学数据以及对实验数据的解释,都存在较大差异,甚至完全相反.本文以菠菜叶绿体中的PSⅡ颗粒、PSⅡ核心复合物(CP47/CP43/D1/D2/Cyt b559)和PSⅡ反应中心复合物(D1/D2/Cyt b559)为材料,用皮秒和飞秒激光技术对光系统Ⅱ反应中心电荷分离和能量传递的动力学进行研究,测定出光系统Ⅱ反应中心内部β-胡萝卜素和原初电子供体P680之间的能量传递以及PSⅡ反应中心原初电荷分离的时间常数,提出了可能的动力学模型.     

光系统Ⅱ中磷脂极性基团的缺失导致其放氧活性和蛋白质二级结构的改变

通过氧极谱技术和傅里叶变换红外光谱（FT－IR）技术，用酶学方法对光系统Ⅱ（PSⅡ）中惟一的磷脂－磷脂酰甘油（PG）极性基团的作用进行了探讨，结果表明，PG极性基团的缺失导致PSⅡ放氧活性的降, 时影响PSⅡ蛋白质的结构，引起蛋白质二级结构中α－螺旋（α－helix)的增加和β－股（β－strand)的减少，这说明PG分子中的极性基因与PSⅡ蛋白质之间存在着氢键作用，并有利于维持PSⅡ蛋白质的适宜结构，进而影响PSⅡ的放氧活性。     

类囊体膜中磷脂酰甘油向磷脂酸的转变促进光系统Ⅱ的光合电子传递活性

运用酶学方法通过氧电极极谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层色谱技术和方法探讨了磷脂酶D处理对类囊体膜生理功能的影响. 结果表明, 磷脂酶D处理导致类囊体膜中惟一的磷脂——磷脂酰甘油(PG)发生降解, 并产生新的磷脂——磷脂酸(PA). 磷脂酰甘油向磷脂酸的转换导致类囊体膜中光系统Ⅱ(PSⅡ)电子传递活性的增加, 并使类囊体膜产生解偶联效应. 结果说明PG极性基团在维持类囊体膜的正常生理功能方面具有调控作用.     

磷脂酰甘油对缺钙光系统Ⅱ放氧活性的影响

磷脂酰甘油对缺钙光系统Ⅱ的放氧活性具有显著的影响,即ＰＧ可以Ⅱ颗粒因缺钙而受抑制的放氧活性得到恢复。外加Ｃａ＾２＋可使表现出对ｄＣａＰＳⅡ放氧活性的更大促进作用,阻随Ｃａ＾２＋浓度的增加,促进作用也越显著。     

与光系统Ⅱ颗粒结合的蛋白酶的初步分析

叶绿体是植物进行光合作用的细胞器,光合作用中光能的吸收、传递和转化、水的裂解及光合磷酸化等功能均是在具有一定分子排列和空间构象并镶嵌于类囊体膜上的叶绿素蛋白复合体中进行的。叶绿体类囊体膜蛋白的周转需要多种蛋白酶的水解作用。在蛋白质合成后加工成熟中,已证实光系统Ⅱ(PS Ⅱ)反应中心D1蛋白(Q_B结合蛋白)的C-末端加工需要一个类囊体膜结合的蛋白酶,质体菁N-末端加工也需要一个类囊体结合的蛋白酶,与PSⅡ水裂解相关联的三种外在性水溶性蛋白如同Cyt.b-f在整合到膜上时需要类囊体膜结合     

大豆具放氧活性的光系统Ⅱ亚叶绿体颗粒

近二十年来人们应用了分别富含两个光系统(光系统Ⅰ和光系统Ⅱ)之一的亚叶绿体颗粒作材料,极大地推进了对绿色植物和藻的光合作用的研究,虽多年前已从菠菜制备了高度富含光系统Ⅱ且具有光化学活性的颗粒,并且这样的颗粒最近也从蓝绿藻得到,但它们均不具有光诱导放氧的光系统Ⅱ这一重要属性。这就使这些颗粒在作为进一步研     

光系统Ⅱ反应中心的LB膜的形成及其圆二色性光谱的研究

由D1、D2及细胞色素b-559(cyt-559)3个多肽及其内部镶嵌的大约定4～6个che a,2个pheo a和1～2个β胡罗卜素组成的高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心属于膜蛋白,因其难于结晶,人们至今还无法利用X射线技术获得该蛋白的精确解.近年来,利用膜蛋白二维晶体通过电子显微镜与象重构技术获得三维结构信息的方法有很大的进展,而有序二维晶体的获得是关键的一步.本工作的目的是试图利用单分子膜技术形成保持与自然状态光谱性质类似的PSⅡ反应中心动的Langmuir-Blodgett(LB)膜,为进一步利用该技术形成二维晶体并研究其结构打下基础.并采用圆二色性对其构象进行了研究.1 材料和方法1.1 材料PSⅡ反应中心D1/D2/cyt-559复合物的分离纯化参照Nanba和Satoh的方法,从第一     

水氧化释放质子与H~+-ATP酶复合体的CF_0之间的联系

光合电子传递链有两个释放质子的部位,一是位于类囊体膜内侧的光系统Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)放氧复合体氧化水时释放质子(H_(H_2O)~+),另一是与光系统Ⅰ(PhotosystemⅠ,PSⅠ)相联系的质醌(Plastoquinone,PQ)氧化还原跨膜携带质子在类囊体膜内侧释放(H_(PQH_2)~+).这些质子在经H~+-ATP酶复合体(CF_0-CF_1)的质子通道CF。流出时偶联ATP合成.但是,这些质子如何从它们的释放部位传导到CF_0(是经过类囊体腔内水相还是在膜上有专门的途     

温度影响集胞蓝藻PCC 6803叶绿素荧光在作用光关闭后短期上升的机制探讨

<正>许多研究认为光系统I(PSI)循环电子传递的功能是提供ATP和产生质子动力势保护反应中心免受多余光能的破坏等,然而由于测定其反应较困难,人们对PSⅠ循环电子传递在活体内运转的机理尚欠了解.近年来,在C₄植物、C₃植物以及蓝藻中发现了作用光关闭后荧光短期上升现象(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence),认为这是由于NADPH等光下积累的还原产物还原质醌(PQ)所致,因而可以间接地反映PSⅠ循环电子传递,这就为活体内研究PSⅠ循环电子传递提供了简捷的研究手段.过去的工作已表明,单细胞集胞蓝藻(Synechocystis)PCC 6803在作用光关闭后荧光短期上升现象与类囊体膜上的NAD(P)H脱氢酶介导的PSⅠ循环电子传递有关,其显著程度受温度影响,但是温度影响的机制尚不清楚.Murata等的研究表明,光合放氧等光合电子传递等的Arrhenius图的活化能改变折点可以作为膜脂物理相变温度的指示.本文测定集胞蓝藻PCC 6803中反映PSⅠ循环电子传递速度的作用光关闭后荧光上升速度的Arrhenius图,比较和分析它与光合放氧的关系以及能增加膜脂流动性的乙醇的影响,我们的结果表明,PSⅠ循环电子传递与类囊体膜脂状态有着密切的关系.     

温度影响集胞蓝藻PCC 6803叶绿素荧光在作用光关闭后短期上升的机制探讨

许多研究认为光系统I(PSI)循环电子传递的功能是提供ATP和产生质子动力势保护反应中心免受多余光能的破坏等,然而由于测定其反应较困难,人们对PSⅠ循环电子传递在活体内运转的机理尚欠了解.近年来,在C_4植物、C_3植物以及蓝藻中发现了作用光关闭后荧光短期上升现象(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence),认为这是由于NADPH等光下积累的还原产物还原质醌(PQ)所致,因而可以间接地反映PSⅠ循环电子传递,这就为活体内研究PSⅠ循环电子传递提供了简捷的研究手段.过去的工作已表明,单细胞集胞蓝藻(Synechocystis)PCC 6803在作用光关闭后荧光短期上升现象与类囊体膜上的NAD(P)H脱氢酶介导的PSⅠ循环电子传递有关,其显著程度受温度影响,但是温度影响的机制尚不清楚.Murata等的研究表明,光合放氧等光合电子传递等的Arrhenius图的活化能改变折点可以作为膜脂物理相变温度的指示.本文测定集胞蓝藻PCC 6803中反映PSⅠ循环电子传递速度的作用光关闭后荧光上升速度的Arrhenius图,比较和分析它与光合放氧的关系以及能增加膜脂流动性的乙醇的影响,我们的结果表明,PSⅠ循环电子传递与类囊体膜脂状态有着密切的关系.     

光合作用放氧反应

光合作用放氧中心(OEC)是植物光系统II(PSII)中利用太阳能高效、安全地将水氧化,释放出电子、质子和氧气的生物催化剂。OEC的合成、结构和催化机理及其仿生模拟一直是光合领域广受关注的研究热点和难点。近年PSII高分辨率晶体结构研究揭示出OEC是一个特殊的Mn₄CaO₅ 簇合物,这一重要进展使人类可以在原子水平上探讨光合放氧反应的微观机理,同时也为OEC的人工合成提供了重要依据。我们近年来成功合成出结构和理化性能均与生物OEC类似的系列仿生Mn₄CaO₄簇合物,为研究OEC的微观机理提供了理想的化学模型,同时也为发展高效、廉价人工光合作用水裂解催化剂奠定了基础。目前无论是自然光合放氧研究,还是人工光合放氧研究都有大量重要的科学问题亟待深入研究。     

藻胆体-类囊体膜复合物内能量传递机制研究——Ⅰ.光状态转换技术和光谱解叠方法

<正>目前,对藻类光合作用原初过程的研究大多集中在藻胆体(PBS)、孤立藻胆蛋白(Biliproteins)及PSⅡ和PSⅠ反应中心上,得出激发能在这些复合物内的定性流向和定量参数,从而为这一领域进行深入研究奠定了可靠的基础。然而,由于上述研究是对孤立的或部分的光合器而不是对整体来进行的,所以,它不可能解释藻胆体为什么能将其所吸收的光能高效地和快速地传递给反应中心并将其在两个反应中心(PSⅡ和PSⅠ)之间进行合理地分配。为了解决这一问题,一些研究人员利用光状态转换(Light state transition)技术和时间分辨光谱技术对整藻细胞进行研究,基于研究结果,人们对藻胆体向光合反应中心能量传递机制找出3种可能的模式:(1)“溢出”模型(Spillover over model),该模型认为:能量传递途径是PBS-PSⅡ-PSⅠ;(2)二元复合物模型,也就是说PBS-PSⅡ复合物和PBS-PSⅠ复合物独立存在,能量传递途径是PBS-PSⅡ和PBS-PSⅠ;(3)三元复合物模型,它认为存在一个三元复合物(PSⅡ-PBS-PSⅠ),能量从PBS向PSⅡ和PSⅠ分配是通过PBS在该复合物中精确的位移来调节的。许多研究结果表明能量“溢出”模型不是能量从PBS向PSⅠ传递的主要途径。目前蓝藻光合作用光状态1和光状态2的相互转换的分子作用机制还不清楚,鉴于此,本文通过对藻胆体-类囊体膜复合物状态转换进行研究,以便探测出能量是如何从PBS传递给PSⅡ和PSⅠ这两个反应中心的。     

重组蓝细菌PsbF亚基形成β:β同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统-- 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示,二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

强光照处理菠菜叶片产生的交联聚合物中D1蛋白部分发生磷酸化

利用D1蛋白特异性抗体, 在强光照(800~2500 μmol photons·m^-2·s^-1)处理3 h的菠菜叶片类囊体膜中检测到4种D1蛋白聚合物, 它们的相对含量与处理时光照强度相关. 进一步分析表明, 70 kD聚合物为D1蛋白与CP43交联产物, 65和60 kD聚合物是D1蛋白与D2蛋白交联产物, 41 kD聚合物是D1蛋白与细胞色素b₅₅₉ α亚基交联物. 1000 μmol photons·m^-2·s^-1光照处理生成的D1/Cyt b₅₅₉聚合物最多, 光强增加时其含量下降. 磷酸化苏氨酸抗体Western blot分析结果显示, D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物中存在磷酸化蛋白; 外加磷酸酯酶处理后, 磷酸化的D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物减少. 上述结果表明, 强光照处理叶片引起D1蛋白与其他PSⅡ核心蛋白交联, 所生成的聚合物中部分D1蛋白以磷酸化形式存在.     

藻胆体-类囊体膜复合物内能量传递机制研究——Ⅱ.皮秒级时间分辨荧光发射光谱(77K)方法

在前文,我们利用稳态光谱技术(77K)和光谱解叠方法对藻胆体-类囊体膜复合物在不同光状态条件下能量传递途径及机制进行详细研究。结果表明:在该复合物内,能量由藻胆体(PBS)向两个反应中心(PSⅠ和PSⅡ)的传递是并行的,只是在不同光状态条件下,能量由PBS向PSⅡ和PSⅠ反应中心传递的能量份额发生相对变化而已,即二元复合物模型。为了进一步证实前文的结论,本文通过皮秒级时间分辨荧光发射光谱技术对藻胆体-类囊体膜复合物内的能量传递途径和机制进行深入的研究。