谈谈细胞的传代培养

细胞传代培养是组织培养中一项重要的工作。组织培养包括组织、器官和细胞的培养。由于细胞培养比组织和器官培养应用广泛,所以讲组织培养主要是指细胞培养。细胞培养包括由培养的组织块发展成单层细胞、制备原代细胞培育成单层细胞、原代细胞的再培养、建立细胞株、细胞系等五个方面内容。前两者都是新制备培育的细胞,后三者则是靠细胞传代而得到大量细胞。细胞传代比起新制备的细胞有很多优点,如可节     

大鼠细小病毒KRV株培养方法的建立

目的 建立用大鼠胶质瘤细胞系( Rat glial cell line C6)替代大鼠原代胚细胞(Primary rat embryo cells,RE)来 培养大鼠细小病毒（Kilham Rat Virus,KRV）的方法。方法 将500 TCID50 KRV培养物接种到75T-C6细胞培养瓶 中（ 细胞接种量为2×105/mL）, 培养过夜, 待细胞病变CPE达++～+++时, 分别用免疫荧光(FITC)鉴定所培 养病毒的特异抗原,用血球凝集试验(HA)测定培养物上清的效价,用DNA测序鉴定所培养的病毒,最后用96孔 板培养法测定KRV的TCID50。结果 KRV在接种到C6细胞的第4～5天, 细胞发生明显的病变,CPE可达++++, FITC鉴定呈KRV抗原阳性, 病毒的培养上清中HA效价为1:5 120,测序结果表明, 该病毒序列与NCBI中KRV序 列同源性达98％ , 确定为KRV。收获的KRV的TCID50为104.6/0.1 mL。结论 通过对C6细胞系培养KRV方法 的标准化和对所培养病毒的一系列鉴定表明,用大鼠胶质瘤细胞系可以替代大鼠原代胚细胞系进行大鼠细小病毒 的培养。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。     

牦牛心脏原代成纤维细胞系的建立及鉴定

旨在建立牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系并对其进行鉴定.以牦牛胚胎心脏组织块为研究对象,运用组织块法对其进行分离培养获得原代细胞,使用胰酶消化法对原代细胞进行传代培养,通过MTT法检测细胞增殖活性,利用HE染色法及秋水仙素处理染色体鉴定细胞外形,选取4个成纤维标志性基因TGF-β、FSP-1、S100A4、Vimentin,通过RT-qPCR技术对基因的表达情况进行鉴定.结果显示成功将原代分离培养的成纤维细胞传代至11代;通过外型的一系列检测方法发现其符合成纤维细胞的外形,该细胞活力充足,生长规律符合“S”型生长曲线;荧光定量检测以上四种成纤维细胞特征性基因在不同代数中均表达且相对稳定,结果证实分离培养出的细胞符合成纤维细胞系的分子表达特征.本研究成功建立了牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系,集成了该细胞系的鉴定流程,为今后牦牛进一步研究提供相关的细胞系平台.     

牛泡沫病毒BBet抑制BTas反式激活功能负调控病毒复制

泡沫病毒(foamy virus, FV)属于反转录病毒科中的泡沫病毒亚科、泡沫病毒属.其基因组除编码结构蛋白Gag、Pol及Env外,同时还编码2个非结构蛋白Tas和Bet.Tas是泡沫病毒的正调控蛋白,通过结合在病毒启动子上游的DNA调控元件上正调控病毒基因表达.Bet对病毒复制具有一定的负调控作用,但作用机制尚无报道.利用实验室筛选得到的牛泡沫病毒(bovine fomay virus, BFV)3026可释放株(BFV-Z1),采用不同感染复数(0.01及0.1)感染BFV Bet(BBet)稳定表达细胞系及对照细胞系,分析传代后病毒滴度,确证BBet抑制BFV复制;分析BBet对病毒启动子活性的影响,发现Bet对BFV的2个启动子LTR和IP本底活性影响较小,但BBet可抑制BFV Tas(BTas)对BFV的LTR和IP启动子的反式激活.进一步机制分析发现BBet未显著影响BTas的细胞定位,也不能直接结合启动子上游BTas相关应答序列,推测BBet可能通过抑制BTas结合启动子应答元件之后的分子事件,如募集转录复合物等过程负调控病毒复制.     

病毒载体疫苗研究进展

从非复制性病毒（家禽痘、野鸟痘、痘苗和人类腺病毒）载体重组活疫苗、腺病毒载体重组口服活疫苗和杆状病毒载体重组亚单位疫苗三方面，评述了以病毒为表达载体的基因工程疫苗近年研究取得的重大进展。     

人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系.     

细胞培养法增殖油桐尺蠖NPV工艺条件

探讨了用油桐尺蠖成虫卵巢细胞系 (Bs4 84细胞系 )增殖油桐尺蠖核型多角体病毒 (BsNPV)的若干工艺条件。结果显示 ,病虫血淋巴在不同温度条件下保存 ,4℃一个月内 ,- 2 0℃和液氮中 4～ 6个月内 ,病毒仍具有实用水平的活性 ;感染后的细胞培养物 ,用超声波破碎优于液氮冻融法 ;感染后的细胞培养物培养2 4 ,36 ,4 8,6 0 ,72h取样 ,超声波破碎 ,培养 6 0h的样品具有较高病毒滴度 ;于感染后第 4 ,5,6 ,7d取样 ,细胞不破碎 ,第 5～ 6天病毒滴度达较高值。     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程

目的通过培养小鼠原代组织细胞,检验本科室己建立的一套细胞实验室技术操作规程能否满足细胞培养要求。方法培养小鼠原代成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞和胚胎成纤维细胞。计算原代培养成活率、传代成活率、冷冻及复苏成活率。结果成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞、胚胎成纤维细胞原代培养成活率分别为89%、96%、100%、100%、100%、80%、100%和90%;传代成活率分别为76%、93%、100%、92%、100%、66%、80%和92%;冷冻及复苏成活率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。结论通过计算KM小鼠8种组织细胞原代培养、传代、冷冻与复苏的成活率,证明现有的细胞室技术操作规程基本上能够保证成功培养出常规原代细胞,并能传代、冷冻和复苏。     

传代培养对嵌合型非整倍体计数嵌合比例的影响

探讨嵌合型非整倍体样本经传代培养后,对嵌合比例的影响。将两例(21-三体综合征、特纳综合征)嵌合型非整倍体患者外周血样本进行体外培养,72h传代一次,连续传代两次。用原位荧光杂交(FISH)技术检测原代、传代1、传代2样本中嵌合比例的变化情况。嵌合型21-三体综合征异常细胞比例分别为原代(189/200)、传代1(165/200)、传代2(139/200);嵌合型特纳综合征异常细胞比例分别为原代(142/200)、传代1(73/200)、传代2(55/200)。嵌合型非整倍体样本经传代培养后,异常细胞所占比例逐渐减少,利用传代细胞进行疾病诊断时容易出现漏诊或误诊,原代细胞更适用于疾病的诊断。     

鲢和鳙单倍体和二倍体单个囊胚的细胞培养

对鲢、鳙单倍体和二倍体单个囊胚胚胎进行培养.结果表明,单倍体和二倍体细胞对培养条件的要求相差不大,其原代培养细胞的生长特点表现为新生细胞主要沿着组织块边缘重叠生长,向外扩展生长的速度非常缓慢.二倍体的鲢和鳙胚胎细胞培养物成活率相对高于单倍体,其中鲢二倍体胚胎细胞传代细胞占细胞培养数的18.06%.本结果对深入开展鲢、鳙核移植及胚胎干细胞研究具有积极意义.     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

斑节对虾肝胰腺和血淋巴组织细胞的体外培养

用斑节对虾(Penaeusmonodon)的肝胰腺组织及血淋巴细胞进行了体外培养,结果表明肝胰腺细胞培养共传3代,促肝细胞生长因子效果不明显．血淋巴细胞原代培养很成功,血淋巴细胞90％多为贴壁生长,其中圆形悬浮生长细胞可见分裂相,少数瓶细胞传代6次,生长时间达半年之久,加入PHA后,对细胞没有明显刺激作用．     

菜蛾科小菜蛾(Plutella xylostella)细胞系的建立

第一株小菜蛾(Plutella xylostella)蛹发展起来的细胞系已经建成并命名为BCIRL-PX2-HNU3.BCIRL-PX2-HNU3是由20个剪碎的全蛹经过消化处理,培养在TC-199-MK 培养基中建立起来的.原代培养只历时48天就开始了第一次转代,由于细胞增殖快而稳定、此后即按1∶2的分裂比值,每周转代三次,待转代100次后,改按1∶10的比值转代,每周一次,至目前为止,该细胞已传至115代.BC1RL-PX2-HNU3细胞仅疏松贴附瓶壁,容易从瓶壁脱落.转代时,不需用消化酶.细胞的形状多种多样,但以园形和卵园形为主.28℃时,96小时细胞群体倍增时间为30小时±2.06.1×10~5/毫升细胞培养8天后,最大密度可达1.3×10~6细胞/毫升.该细胞系细胞的染色体粗短,多为多倍体,具有鳞翅目昆虫染色体的典型性状.用磷酸葡萄糖异构酶作等电聚焦,该细胞系与一些其他细胞系有明显差异.试验表明:BC1RL-PX2-HNU3细胞系对苜蓿尺蠖(Autographa californica)的核型多角体病毒以及中国棉铃虫(Heliothis armigera)病毒VHA—273敏感,并能复制出多角体.另外,用小菜蛾颗粒体病毒感染该细胞系,6天后,电镜切片证实培养的细胞胞质内出现了颗粒体病毒的蒴伏体,但在随后的多次试验中,未能重复.     

鹿茸组织和细胞原代培养和继代培养研究

本文对鹿茸皮肤及肉质部分组织块的培养及继代培养方法、从鹿茸各组织中分离细胞的方法及分离细胞的原代培养和继代培养进行了研究。由鹿茸皮肤细胞建立的细胞系已在体外培养了近四个月,传至第三十代,由鹿茸的肉质部分建立的细胞系已在体外传了二十几代。传代工作仍在继续。     

含狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒(RTTVV-3)传代后生物学特性研究

将重组病毒在原代鸡胚细胞上连续传至30代(P30),其结果P30与第11代(P11)一样,在含中性红和X-gal的琼脂糖平板上为蓝色蚀斑;空斑法测定P11至P30,各代病毒滴度均稳定在3×10~7PFU/mL～4×10~7PFU/mL;血凝试验表明。不同代次的血凝滴度基本稳定在相同水平;Western blot检测P30与P11在同一位置出现相同蛋白带;血清中和试验证实传代后的重组病毒抗原活性及保护性稳定。重组病毒经传30代后,在生物学特性和表达水平上都具有良好的遗传稳定性。     

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养，并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系，细胞出现了明显的细胞病变（Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体，胞质中散在6角形、5角形或圆形的病毒粒子，大小为100－140nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

棉铃虫Heliothis armigera(Hbn.)一个新细胞系的建立

原代培养新细胞系是由9条棉铃虫雌蛹发展起来的。此工作开始于1980年12月4日。开始进行原代培养所采用的技术程序和建立细胞系所采用的培养基都与McIntosh等(1981)所描述的有关事项相同。传代培养1981年5月22日原代培养用胰蛋白酶消化,并将细胞培养仍接种在     

成人骨髓基质细胞的体外培养

本研究从成人的髋骨抽取骨髓液，离心后将骨髓基质细胞悬液接种培养，待细胞贴壁融合后，进行传代扩增培养．并采用流式细胞术进行细胞周期分析，结果表明原代培养和传代培养的细胞均为贴壁、形态不一的骨髓基质细胞，且此体外培养的骨髓基质细胞具有很强的增殖能力．本研究成功地建立了一套完整、简单、可行的体外分离、长期培养扩增人骨髓基质细胞(Human Bone Marrow Stromal Cells hBMSCs)的系统，证明成人骨髓基质细胞能够在体外长期增殖，为人的骨髓基盾细胞的理论研究和临床应用奠定了基础.