抗甲型流感病毒H1N1亚型单克隆抗体制备及应用

采用快速免疫佐剂免疫小鼠,通过杂交瘤技术获得针对甲型流感病毒H1N1亚型的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株.共获得7株能稳定分泌特异性抗体的细胞株,经腹水诱生和Protein A亲和层析纯化的抗体用于标记荧光量子点,并基于双抗体夹心免疫层析检测用于对甲型流感病毒H1N1亚型的检测.针对甲型流感病毒H1N1亚型,检出限为3.06×10~3TCID_(50)/L,具有较高的灵敏度,所制备的抗体在检测中具有良好的特异性和准确性,可用于对甲型流感病毒H1N1亚型的现场快速检测.     

禽流感病毒H9亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 采用禽流感病毒多克隆抗体及H9亚型特异性单克隆抗体,研究建立H9亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H9亚型禽流感病毒.优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.通过使用该方法对野外样品进行检测.结果表明该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H9亚型禽流感病毒.     

禽流感病毒H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.同时使用该方法对野外样品进行检测.结果表明:该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒.     

禽流感病毒型及亚型特异性免疫酶染色技术的研究

 在获得禽流感病毒型及亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立型及亚型特异性免疫酶染色技术,用于检测或鉴定禽流感病毒．优化反应条件,确定单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记二抗的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与病毒分离鉴定比较．结果表明该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床组织样品、鸡胚及细胞培养物中的禽流感病毒．     

禽流感病毒三种检测方法的比较研究

对分别应用病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光(IFA)3种方法对病料组织中的禽流感病毒(AIV) 进行检测与比较研究。结果显示:经鸡胚尿囊腔接种分离到的病毒,通过用禽流感病毒H5、H9亚型单克隆抗体所进行的血凝(HA)和血凝抑制试验(HI),鉴定为AIV H5亚型毒株;应用RT-PCR技术直接对病料组织抽提的RNA样品进行检测,从病料组织能扩增出大小为229bp的AIV通用目的片段和大小为380bp的H5亚型特异性片段;取病料组织的过滤液接种狗肾上皮细胞(MDCK)单层,24h后用H5亚型AIV特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果在细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。研究的结果表明,3种技术都可对病料样品中的AIV进行检测,而RT-PCR和IFA两种方法还可直接对病料样品中的病毒进行亚型的鉴定。相对而言,后两者具有更快速、更敏感、操作更简便的特点。     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

对6种禽流感病毒通用型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),PCR检测试剂盒进行比对与科学评价,为实验室采购提供依据。利用禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准品,鸡新城疫活疫苗与传染性支气管炎活疫苗对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对,并对97份临床样品进行了检测,筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。结果表明:A厂家试剂盒最低可检出1:100倍稀释的H7亚型标准品浓度,B厂家试剂盒最低可检出1:1倍稀释的H7亚型标准品浓度,C厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,D厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,E厂家试剂盒最低可检出1:1 000倍稀释的H7亚型标准品浓度, F厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,6种试剂盒特异性均良好。综上,E厂家试剂盒优于其他厂家试剂盒,可以作为动物疫病检测实验室在实施监测任务中的首要选择。     

高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究

高致病性禽流感病毒高度变异且缺乏有效的治疗药物.在前期研究工作中,本课题组发现一株鼠源广谱中和单抗13D4,在动物实验中显示出对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果.在本研究中,从分泌13D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出轻重链可变区DNA序列,并分别与人IgG1的轻重链恒定区基因序列拼接,构建人-鼠嵌合抗体.筛选出稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株,从培养上清中纯化出嵌合抗体.竞争Elisa结果表明,嵌合抗体与鼠源单抗能够识别同一个抗原表位并具有相似的亲和力.血凝抑制反应和中和活性测定结果证明,13D4嵌合抗体保留了对不同亚型H5N1病毒的广谱反应性,并且对两株H5N1病毒具有中和活性.本研究获得的13D4嵌合抗体将具有潜在的治疗价值.     

病毒样颗粒为阳性对照的H5N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性H5N1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将H5N1AIV HA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DNA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有H5N1AIV HA基因RNA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测H5N1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性H5N1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.     

野生动物疫源性疾病

自2003年12月开始,新型禽流感病毒肆虐东亚,包括我国在内的10个国家和地区遭受禽流感袭击。禽流感是禽流行性感冒的简称,这是由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合症,被国际兽疫局定为A类传染病。按病原体的类型,禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状,仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状,食量减少、产蛋量下降,出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重,发病率和死亡率较高。至今由禽鸟传给人的禽流感有三种,分别是H5N1亚型,H7N7亚型及H9N2亚…     

"鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的研究与产业化"项目简介

公司"鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的研究与产业化"项目研究以新城疫病毒和禽流感H9亚型病毒为材料,感染鸡胚液经甲醛灭活后保留其免疫原性,以一定比例与油佐剂混合乳化,研制成一种能够"一针防两病"的新型疫苗.其间针对疫苗生产过程中的各个环节进行研究,解决了联苗技术,成功将鸡新城疫病毒与禽流感H9亚型病毒联合,而且达到并超过了单苗的防治效果,属国内领先技术;研究出新配方,解决了油乳剂灭活苗致注射部位变绿的行业难题,同时大大降低了疫苗粘度,使注射更轻松.采用浓缩技术,抗原含量是普通苗的2-3倍,使免疫后14天即可产生保护力;免疫保护率比普通苗更高,解决了普通疫苗免疫效果不确实的问题;采用进口佐剂和先进的乳化工艺,使得抗体保护持续时间比普通苗更长.     

中国大陆H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传分析及抗原相关性研究

为研究我国大陆H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化及抗原相关性, 本研究对来自15个省、市、自治区的34株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行了测序及系统发育分析, 并采用交叉血凝抑制试验及交叉攻毒保护试验对不同遗传分支下毒株间抗原相关性进行了分析. 结果表明, 所有34个毒株HA基因均符合低致病性禽流感病毒的特征, 但毒株间变异程度增加. 系统发育分析表明, 我国大陆H9N2亚型禽流感病毒主要分为三个系列, 各系列内毒株没有明显的地区及时间特征. 抗原相关性研究表明, 不同遗传系列下的毒株其抗原相关性明显低于同一系列内部毒株间的抗原相关性, 说明我国H9N2亚型禽流感病毒抗原性差异较大. 此外, 本研究同时筛选得到了用于制备多价苗的代表毒株.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

GFAP单克隆抗体制备及ELISA检测方法研究

制备抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体,并尝试建立双抗夹心ELISA检测方法,为出血性脑卒中早期诊断提供基础材料.用重组人GFAP作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗GFAP单克隆抗体;用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体的亚类、表位和特异性;采用ELISA技术制备GFAP检测试剂盒.获得了7株抗GFAP单克隆抗体,抗体亚类为Ig G2或Ig G1,抗体特异性好.抗体配对成功,ELISA检测重组人GFAP灵敏且稳定.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

H5N1快速检测技术在美获批使用

4月7日，美国食品和药物管理局批准使用一种H5N1型禽流感病毒快速检测技术，用这种技术可以在40分钟内检测出人是否感染了H5N1型禽流感病毒。     

野生鸟类在禽流感传播中所起的作用

野生鸟类很可能是高致病性禽流感（HPAI）在全球传播的媒介．这一论点来自于全球机构在过去数十年对野生鸟类体内禽流感病毒的调查、检测和统计结果．这一结果表明：（1）禽流感病毒能够感染所有种类的野鸟,但以雁鸭类为主的水禽是病毒的天然贮存库;（2）多数禽流感病毒亚型对宿主具有选择性,共同感染多种病毒亚型具有非随机性,这使病毒基因重组突变产生亚型的机会并不多,此结论建议防控野生鸟类传播禽流感的基本措施是：（1）隔离各类动物,避免相互接触．提高生物安全措施;（2）针对数量庞大的水禽．建立高效的检测和监测机制．     

注射H5N1亚型禽流感抗体鸡的血清抗体水平消长规律监测

为了解H5N1亚型禽流感纯化抗体(IgG)在鸡体内消长规律,用血凝抑制试验检测了不同注射时间分离的血清样品。结果表明IgG接种后第1至5天,血清抗体滴度恒定在24~26,第8天为23~24,第10天以后几乎检测不到抗体。上述数据表明注射滴度为29的抗体液1mL可有效保护肉鸡免受禽流感病毒的感染,有效期为8天。     

微科普

<正>科学松鼠会人的上呼吸道(鼻窦粘膜、咽喉、气管和支气管细胞)主要分布着α-2,6唾液酸受体。本来,人流感病毒(主要是H1,H2和H3亚型)对其亲和力较大,但突变后的禽流感病毒也具有了相当的亲和力,比如H5N 1和H7N 9型。这也是为什么现在H 7N 9禽流感让人类如此重视的原因之一。