亲和层析提取抑肽酶的研究

4%琼脂糖在碱性条件下与对β-硫酸酯乙砜基苯胺反应,制得了对氨基苯磺酰乙基琼脂糖,经重氮化和胰蛋白酶偶联,固定化胰蛋白酶活力回收55%,较其它三种固定化方法效果均好。用这种固定化胰蛋白酶纯化抑肽酶(胰蛋白酶抑制剂)抑肽酶的纯度提高150倍。     

萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala cv.Salvador)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala cv.Salvador seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提之后,经CM-Sepharose阳离子交换层析得到LlsTI纯品.该胰蛋白抑制剂为19.8kDa的单体蛋白.其N末端测序结果为KGSYLRDVRG,而其内部则含有一段KTAPLVVGFLK的序列,与已知的蛋白酶抑制剂序列都不同,表明LlsTI为一种新的胰蛋白酶抑制剂,同时也含有一部分与已知Kunitz型抑制剂相保守的碱基.LlsTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比近似为1∶1.其对于胰蛋白酶属竞争性抑制剂,其Ki值为2.77×10-10 M.LlsTI对胰蛋白酶的抑制活力表现出对高温和pH变化较高的耐受性.但其活性受100mM DTT影响.本研究对LlsTI对其它丝氨酸类蛋白酶的抑制作用也做了测定,其中只有胰蛋白酶的活性受到了抑制.根据圆二色谱的分析结果,LlsTI是一种αβ蛋白,其二级结构在室温下的水和缓冲液Tris-HCl(pH7.5)中组成相似.     

具有抑制糖苷酶和胰蛋白酶双重活性的亚麻多肽的大肠杆菌重组表达及其活性分析

亚麻胰蛋白酶抑制剂(Linum usitatissimum L.LUTI)是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。文章将LUTI基因连接在pGEX-6p-1载体上获得重组载体pGEX-6p-1-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)表达,经GST-Sepharose4B、Prescission Protease酶切GST标签、Sephacryl S-200凝胶层析,获得分子量大小为8kDa电泳纯的重组LUTI(rLUTI)。经抑制活性测定,相比天然的LUTI,rLUTI对胰蛋白酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性明显提升。二硫键存在与否对两种酶的抑制活力均有影响。利用定点突变技术获得rLUTI的C4/A,C49/A,C4、49/A突变体,进一步双酶抑制活性及CD结构分析显示,rLUTI的C4/A、C49/A及C4、49/A突变体对胰蛋白酶抑制活性影响尤为明显,α-葡萄糖苷酶的抑制活性略微下降;其中rLUTI的C49/A及C4、49/A突变体完全丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。C4/A的突变对rLUTI的二级结构影响最为明显,导致α螺旋结构含量的降低。以上结果表明rLUTI第4位氨基酸Cys是影响其二级结构的关键位点,第49位氨基酸Cys则在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在胰蛋白抑制活性方面尤为突出。     

介孔分子筛SBA-15中胰蛋白酶组装及催化活性研究

在酸性条件下以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源、非离子表面活性剂Pluronic P123为模板剂合成了介孔分子筛SBA-15,将其作为载体,对胰蛋白酶进行了固定化研究.其固定化后的装载量、温度、粘度等指标表明,固定化后的酶仍具有较高的酶活性,这为胰蛋白酶的实际应用提供了理论基础.     

胰蛋白酶在两种载体上的固定化效果比较

以片状载体和偶联DEAE的纤维素微球作为固定化载体,以戊二醛作为交联剂,制备固定化胰蛋白酶,研究交联剂浓度、时间、交联温度等条件对交联效果的影响,并对固定化后的胰蛋白酶的效果进行探究.结果显示,在片状载体和纤维素微球上,固定化最适条件大致相同,最适交联剂浓度为2%,胰蛋白酶浓度为3%,最佳交联时间为10h,交联温度和固定化温度均为10℃.纤维素微球和片状载体在相同条件下酶固载量分别达到145mg/g和112.6mg/g,活力回收率分别为17.3%和14%.两种载体相比,纤维素微球作为固定胰蛋白酶的载体效果更佳.     

胰蛋白酶固定化技术研究

以脱乙酰壳聚糖为载体,明胶包埋,戊二醛为交联剂,对胰蛋白酶的固定化条件和固定化胰蛋白酶的性质进行研究。文章报道的新工艺是一种制备固定化胰蛋酶的理想方法,它兼有絮凝法迅速方便、包埋法成型容易和交联法强度大等优点。研究中就交联剂用量、明胶用量、ｐＨ 值以及载体与酶的比例对固定化胰蛋白酶的影响进行比较,在所选择的固定化条件下,固定化酶的活性回收率可达５８．２％ 以上。固定化酶的最适温度为６８ ℃,最适ｐＨ 值为７．９, Ｋｍ 值升高,热稳定性、ｐＨ 值贮存稳定性以及在乙醇溶液中的抗变性亦明显高于可溶性胰蛋白酶。在柱式反应器内,当以２．５％ 酪蛋白为底物时,其操作半衰期为４７ ｄ 左右。     

胰蛋白酶的固定化及其应用研究

通过γ-（2,3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷将胰蛋白酶固定在硅胶载体表面制备固定化胰蛋白酶. 实验测试了pH值,温度,时间等因素对固定胰蛋白酶的影响,利用红外光谱、热失重等方法对固定化胰蛋白酶进行了表征;通过高效液相色谱法考察了在弱碱性条件下固定化胰蛋白酶与16种天然小分子物质的结合情况. 结果表明在25 ℃,pH=8.0,反应18 h的条件下,对胰蛋白酶在硅胶载体上的固定量最大;且固定化胰蛋白酶与黄酮类成分、生物碱类成分、萜类成分有良好的结合,对酸类及嘌呤类小分子物质不结合.      

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

胰蛋白酶固定化新工艺研究

我们以脱乙酰壳聚精为载体，明胶包埋，戊二醛为交联剂，对胰蛋白酶的固定化条件和固定化胰蛋白酶的性质进行了研究．本文报道的新工艺，是一种制备固定化胰蛋酶的理想方法．它兼有絮凝法迅速方便，包埋法成型容易和交联法强度大等优点．本文还就交联剂用量、明胶用量、ＰＨ值以及载体与酶的比例对固定化胰蛋白酶的影响进行了比较．在所选择的固定化条件下，固定化酶的活性回收率可达５６％以上．固定化酶的最适温度为６８℃，最适ＰＨ７．９，Ｋｍ值升高，热稳定性、ＰＨ贮存稳定性以及在乙醇溶液中的抗变性亦明显高于可溶性胰蛋白酶．在柱式反应器内，以２．５％酪蛋白为底物时操作半衰期为４６天左右。     

亲和层析分离经胃蛋白酶水解后的猪胰蛋白酶活性产物

猪胰蛋白酶经胃蛋白酶有限度地水解后的活性产物可以用大豆胰蛋白酶抑制剂STI-Sepharose亲和层析方法分离出三种形式的活性分子:K~(**) ,λ~(**)和μ~(**)胰蛋白酶。三者的分子量与母体酶分子β-胰蛋白酶的分子量相同。它们与特异性底物反应时,三者的活性各异。N末端基测定,表明三者N末端氨基酸的不均一性。结果说明,猪胰蛋白酶经胃蛋白酶水解后在一至两个肽键处发生断裂,由于分子内二硫键的连接,并未导致胰蛋白酶肽链的脱落。     

大豆胰蛋白酶抑制剂的制备与性质测定

用DEAE-纤维素柱层析分级洗脱,从大豆中分离出三种胰蛋白酶抑制剂。以BAEE作底物,测得三种组份对胰蛋白酶的抑制程度为16.6％、25.0％和100％。三种抑制剂的分子量分别为20000、21000和12000,等电点是pH3.4、pH2.7和pH4.5。     

赤小豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质研究

用酸抽提、2.5％TCA热处理、硫酸铵盐析、凝胶层析和DEAE纤维素离子交换层析等方法,从中药赤小豆中分离得到一种胰蛋白酶抑制剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一谱带。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,其分子量为7400。N-末端分析和氨基酸组成测定结果表明,赤小豆胰蛋白酶抑制剂不含半胱氨酸和胱氨酸,是以酪氨酸为N-末端,由54个氨基酸残基组成的单一多肽链。它仅对胰蛋白酶有较强的抑制作用,对胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶均无明显的抑制活力,对热及酸碱亦较稳定。     

从五十种药用植物筛选胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂的生理作用,除保护生物体的一些组织不被胰蛋白酶水解外,对生物的受精~(1)、胚胎的发育~(2)、血液的凝固及抗凝固~(3)都有密切的关系。近年来已发表了胰蛋白酶抑制剂对多种疾病的影响~(4)及其在动物实验和临床治疗研究方面的综合报导~(5)。胰蛋白酶抑制剂作为药物应用有着广阔的前景。目前,对来源于动物的胰蛋白酶抑制剂的研究比植物的多且详细,但其含量极微。植物来源的胰蛋白酶抑制剂的研究也多限于豆科植物的种子。中国医药学是一个伟大的宝库,中草药的种类繁多、来源丰富。本研究的目的是从中草药筛选和提取胰蛋白酶抑制剂,研究其理化性质及生理活性,从而说明其药理作用。本文报导了从五十种药用植物筛选出入种含有胰蛋白酶抑制剂的物质,为今后的进一步研究打下基础。     

金属螯合载体一步纯化与固定化GL-7ACA酰化酶

采用金属鳌合亲和层析技术,以EIP-ARFG-IDA-Co2+为载体,从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7ACA酰化酶.在此基础上进行了固定化方面的研究,其固定化最适条件是150～200U/g给酶量与载体比,固定化时间16 h,固定化介质pH=7.0.固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0.同时还考察了固定化酶的热稳定性、重复利用性及载体的重复使用等特性.     

中国野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

采用分离提取，电泳回收，ＰＡＧＥ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，亲和电泳和抑制活性测定等方法，对我国一年生和多年生野生大豆种子蛋白中的胰蛋白酶抑制剂进行了初步研究。在４５°Ｎ来源一的上生野生大豆中得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。通过电泳迁移率，分子质量，末端分析和抑制活性等测定，证明中ＳＢＴｉ－Ａ２的Ｔｉ＾ｂ型。     

多元有机载体固定化酶水解氨基酸研究

选用反应性单体丙烯酰胺(AM)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHM),以N,N’-亚甲基(双丙烯酰胺)(GM)为交联剂,以甲酰胺为制孔剂条件下进行反相悬浮聚合,得到珠状共聚物载体,该载体是一种新的载体形式,在国内外的相关文献中均未见报道.将载体分别用吸附和包埋两种方法固定化中性蛋白酶,测得吸附和包埋两种载体固定化酶量分别为0.328 0和0.026 4 mg/g,固定化酶的活性分别于175.63~484.72μ/g和50.95~82.25μ/g之间变化,比较吸附法和游离态酶水解蚯蚓体蛋白的氨基酸含量,将中性蛋白酶用吸附法固定在所合成的载体上可得到高活性的生物催化剂.     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。     

新型磁性纳米材料对胰蛋白酶的固定化

通过静电的相互作用,将胰蛋白酶成功地固定于羧甲基壳聚糖磁性纳米颗粒(Fe3O4(PEG+CM-CTS))的表面,研究了固定化过程中的p H值、胰蛋白酶初始质量浓度和固定化时间对胰蛋白酶固载量和相对酶活的影响.研究结果表明:Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的吸附符合Langmuir等温吸附模型,且载体对胰蛋白酶的最大固载量为117.6 mg·g-1,相对酶活性为87.9%.此外,固定化胰蛋白酶的稳定性试验表明:固定化胰蛋白酶在持续的BSA水解过程中,具有良好的操作稳定性以及较高的储藏稳定性.     

固定化胰蛋白酶的制备及其性质研究

以EDTA-Sephadex G-50作载体,戊二醛为交联剂,对胰蛋白酶进行固定化.IR光谱结果显示:该项生化技术使胰蛋白酶得到了有效的固定,并且实现了较好的纯化,同时研究了固定化胰蛋白酶的一些性质,最适温度60℃,最适pH8.0,热稳定性,pH贮存稳定性以及对盐酸胍的稳定性均明显高于天然胰蛋白酶.     

温敏性水凝胶作为固定化酶载体的研究

提出水凝胶载体材料优化模型,根据优化结果制备出了两种性能相异的载体材料即聚丙烯酰胺/2-甲基丙烯酸羟基乙酯和聚N-异丙基丙烯酰胺/2-甲基丙烯酸羟基乙酯,并用其包埋α-胰凝乳蛋白酶,利用载体材料的温敏性可实现固定化酶活力的可控及连续可调,两种固定化酶经连续催化8次,固定化酶活力并无明显下降.