铁皮石斛试管苗的RAPD分析及其特异性鉴定引物设计

为了能方便快捷地鉴别出铁皮石斛试管苗和铁皮石斛,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对铁皮石斛试管苗及石斛属23个种进行了基因组DNA多态性分析,从中找出铁皮石斛试管苗特征性条带进行克隆和测序,并根据测序结果设计了特异性引物.采用此特异性引物对铁皮石斛试管苗及石斛属其他一些种进行扩增,结果表明,铁皮石斛试管苗与各地产野生铁皮石斛出现同一特征条带,而石斛属其他种未出现该条带.     

tRNATrp的种属特异性元件

通过同源性比较原核、古核和真核生物tRNA^Trp的核苷酸序列表明tRNA^Trp的种属特异性元件可能存在于氨基酸接受茎、D茎、反密码茎以及识别位碱基等处．设计并完成了tRNATrp的突变,体外转录及原核、真核两种不同来源的色氨酰tRNA合成酶对tRNA^Trp及其突变体的测活以确定tRNA^Trp的种属特异性元件,进一步揭示tRNA^Trp及其合成酶之间的精确识别和共进化过程．原核野生型tRNA^Trp其接受茎突变成真核相应的核苷酸后失去了被原核色氨酰tRNA合成酶氨酰化的活力,却被赋予了真核合成酶的氨酰化活力．反密码茎、D茎对于氨酰化活力则影响细微．结果表明tRNA^Trp的种属特异性元件主要位于接受茎部位,即氨基酸接受茎和识别位碱基处．研究结果对于tRNA进化及药物的设计具有重要的意义．     

PCR技术对肺炎支原体DNA的检测

作者首次在国内利用自己的条件完成了肺炎支原体从培养基制备、实验室培养、菌种检定、引物设计、ＤＮＡ提取．到ＰＣＲ扩增条件的摸索、产物检测等一整套技术,与非肺炎支原体、部分相关细菌进行了鉴别,并同时进行了临床样品和模拟样品的实验,结果表明该方法的特异性和灵敏性都是好的．     

TPM：基于Taverna的PCR引物设计与评估工作流系统

PCR引物设计是PCR实验中关键而重要的一步,而引物的特异性情况直接影响着PCR实验的成败. 首先,设计了基于多因素（序列相似性,引物3′末端自由能,Tm等）的PCR引物特异性评估工具——MFEprimer;其次,在MFEprimer的基础上,结合引物设计软件primer3,在Taverna工作流平台上构建了PCR引物设计（primer3）与评估（MFEprimer）一体的工作流系统——TPM（Taverna-Primer3-MFEprimer）,实现了从引物设计到评估的自动化分析流程,使用简单方便.     

文昌鱼ALPase底物特异性及其效应物对酶活力的影响

研究了文昌鱼碱性磷酸酶的底物特异性,测定酶催化几种单核苷酸和磷酸酯化合物水解反应的Kcat/Km值,酶对单核苷酸的新和力大小依次为3’-AMP>3’-UMP>3’-CMP>3’-GMP=2’-AMP>ε-AMP>5’-CMP>5’-AMP,研究效应物对酶水解对-硝基苯磷酸的影响表明:无机磷酸盐、砷酸盐为竞争性抑制,L-?丙氨酸为反应竞争性抑制,L-半胱氨酸、二巯基苏糖醇为混合型抑制;并测定于它们的抑制常数。     

绵羊肺炎支原体PCR检测方法的建立

为检测绵羊肺炎支原体感染,根据公开发表的绵羊肺炎支原体16SrRNA序列设计特异性引物。建立了PCR诊断方法。通过对绵羊肺炎支原体标准株、临床分离株、丝状支原体山羊亚种及临床病羊鼻拭子的检测。发现应用该检测方法能够对标准株、分离株和临床病羊鼻拭子扩增出特异性产物,而对丝状支原体山羊亚种则扩增小出。证实所建方法在绵羊支原体性肺炎的诊断上具有特异性、相对快速、简便等优点,值得在临床中推广应用。     

利用随机引物对PCR反应条件的筛选及优化试验

不同试验PCR反应的条件是不完全一致的，在PCR反应进行前就有必要对反应条件进行筛选和优化，因此，提出了对关键实验条件的正交筛选，结合反应的增强与抑制条件，从而筛选出适用于本实验室的最佳反应条件。     

卵形鲳鲹神经坏死病毒基因组的分析及其特异性检测引物的筛选

从海南发病的卵形鲳鲹中分离到一株病毒,经测序分析,推测该病毒为神经坏死病毒.提取病鱼脑部、眼部总RNA,并用其反转的cDNA为模板,分段克隆出RNA1和RNA2片段,测序后通过拼接获得其基因组,命名为GPNNV(Golden Pompano Nervous Necrosis Virus).系统进化树分析结果表明,GPNNV属于RGNNV基因型.为了获得GPNNV特异性强、灵敏度高的检测引物,本研究基于GPNNV的RNA2保守区设计了9对检测引物,然后通过普通PCR及实时荧光定量PCR技术,筛选出1对最佳引物,可以检测到病毒含量为10copies·μL-1的样本.采用筛选出的引物,在病鱼组织中进行检测,结果表明该引物可以准确检测出感染病毒性神经坏死病毒的样本,具有较高的实际应用价值.以上结果可为卵形鲳鲹神经坏死病毒病的诊断提供有效的方法,对卵形鲳鲹神经坏死病毒病的预防具有重要意义.     

真菌诱导物对红豆杉细胞的影响

从红豆杉树皮、根皮中分离得到了十种真菌,由这些真菌制成的真菌诱导物加入到红豆杉细胞培养物中后,均能引起细胞发生过敏反应,细胞生长量下降,培养液ｐＨ值降低,但是各种真菌诱导物对紫杉醇合成的促进作用有很大的差别,最佳的情况为加入真菌诱导物后,紫杉醇的含量达到细胞干重的０．０７％．可为红豆杉细胞大规模培养提高紫杉醇的产量提供依据．     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

物种特异性PCR在中药材白花蛇舌草鉴定中的应用

提供中药材白花蛇舌草物种特异性鉴定引物以及建立简便、高效的特异性鉴定方法和研制鉴定试剂盒．为此收集目前市场上出现的所有白花蛇舌草正伪品样品共9种,并测定所有样品的核糖体基因ITS区核苷酸序列,在此基础上设计一对物种特异性引物B174和B53,特异性地鉴定白花蛇舌草．表明用这对引物扩增白花蛇舌草,获得207bp的特异性产物,而其它伪混品样品没有阳性产物．可以认为用白花蛇舌草特异性鉴定引物B174和B53的所配制的鉴定试剂盒具有很好的应用前景．     

PCR技术检测泌尿生殖道生殖支原体(MG)感染的研究

目的采用PCR检验技术,对吉林地区部分非淋菌性尿道(宫颈)炎(NGU)高危人群泌尿生殖道分泌物标本进行分离鉴定,以探讨MG感染在STD的作用和地位.方法吉林地区NGU高危人群受检者141例,宫颈或尿道口内拭子分泌物标本用PCR技术进行DNA扩增,并与对照组65例进行比较,结果141例标本MG-DNA扩增出26例,阳性率为18.4%,正常对照组65例MG-DNA扩增出3例,阳性率为4.62%(3/65),差异显著(x2=5.933,P=0.014 9＜0.05).结论1)吉林地区STD高危人群有较高的MG感染率,是NGU的病因之一2)PCR技术具有敏感、快速、特异性强特点,可以用来研究MG感染现状,流行情况及致病机制.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

生物制品中支原体污染的快速检测

用两步ＰＣＲ法及ＤＮＡ荧光染色技术,检测了国内部分生物制品研究所生产的８１份不同来源和批号的疫苗及一些实验用细胞株中的支原体,并对检测结果做了比较。     

两种肺支原体培养基质量的比较

对常用的国产培养基与进口的培养基进行了初步的质量比较实验。结果表明 :国产培养基与进口的培养基质量两者无显著差别。定性实验中 ,半流体培养基灵敏度均达到 10 - 7稀释度 ;液体培养基灵敏度均达到 10 - 9稀释度 ;定量实验中 ,两者测定同一样品的活菌数 ,国产培养基的结果为 8 5× 10 8CFU ml;国外培养基为 1× 10 9CFU ml。两种培养基用于支原体保存时 ,在 - 2 0℃条件下 2个月下降 1个对数级 ,但 6个月以上时 ,支原体活性很快下降。肺支原体在进口培养基上的发育状态优于国产培养基。     

人类心房肌细胞的原代培养与鉴定

探索人心房肌细胞的原代培养方法。取心外科手术患者(5/12~57岁,平均6.5岁)常规切除的右心耳,利用酶消化法原代培养心房肌细胞并进行光镜和免疫细胞化学鉴定。结果急性分离的细胞成圆形,1 d后开始贴壁。贴壁的心肌细胞部分聚集成团,成梭形或三角形。随着培养时间延长,细胞逐渐向四周伸展。免疫细胞化学分析显示90%以上的细胞呈横纹肌肌动蛋白染色阳性。说明利用酶消化法成功培养出人心房肌细胞,为深入研究人心房肌细胞基因与功能打下了基础。     

胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究

分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4 D+0.5mg/LKT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125×104个/mL～2.325×104个/50mL时,7d～9d为对数生长期;继代培养4代～5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.     

泌尿生殖道支原体215例培养结果及药敏状况分析

目的了解本地区泌尿生殖道感染者的支原体感染及药敏状况,为临床合理用药提供参考。方法采用上海奥普公司生产的支原体培养鉴定药敏试剂盒进行支原体培养鉴定及药敏试验。结果536例泌尿生殖道感染者中支原体阳性215例,阳性率为40．1％。其中解脲支原体（Uu）阳性161例（30．0％）,人型支原体（Mh）阳性17例（3．2％）,Uu和Mh混合感染37例（6．9％）。对强力霉素、交沙霉素、美满霉素、罗红霉素、氧氟沙星、阿奇霉素、克林霉素耐药率分别为14．0％、15．8％、19．5％、30．2％、34．4％、43．7％、45．6％。结论泌尿生殖道感染者支原体感染率为40．1％,Uu是支原体感染的主要病原体,临床治疗首选强力霉素、交沙霉素和美满霉素。