葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。     

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.     

植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

谷胱甘肽S-转移酶zeta类(GSTZ)是一种重要的多功能酶,与细胞生化代谢、环境净化等密切相关.将拟南芥、甘蓝型油菜"陕2B"和"垦C1"的GSTZ基因重组到表达载体pPIC9,电转化到毕赤酵母株GS115中,得到了分泌表达GSTZ酶的毕赤酵母工程菌株.甲醇诱导表达显示,最佳诱导时间在48～60 h,DCA-DC比活力为83.21～115.31 U/mg,GSTZ分泌量为25.71～42.90 U/mL.研究结果表明,植物GSTZ基因在毕赤酵母中的表达是高效的,为大规模发酵生产GSTZ奠定了基础.     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZα-A 载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM,转化宿主菌Pichia pastoris X-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.     

曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉中提取总RNA,RT-PCR分别获得其糖化酶基因,所得序列在Gen-Bank数据库中注册,注册号分别为AY652617、AY642120和DQ211971.BLAST分析显示,克隆的曲霉属糖化酶基因与GenBank数据库相应序列同源性很高.将这些糖化酶基因与表达载体pPIC9重组后,电转化进毕赤酵母株GS115,均获得了分泌表达糖化酶的酵母工程菌株.甲醇诱导72 h后,糖化酶的分泌量达到最高,分别为(11.6±0.2)、(12.4±0.2)和(10.0±0.2)U/mL.SDS-PAGE显示,分泌表达的糖化酶分子量均约为80 kDa.     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.     

天蚕抗菌肽B在毕赤酵母中的表达

Cecropins B是一种昆虫抗菌肽,具有分子量小,热稳定性、水溶性好、抗菌谱广等优点,更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。根据毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,改造并化学合成天蚕素基因B,克隆到pPIC9K载体中,构建分泌型重组酵母表达载体CB-pPIC9K,转化Pichia pastoris受体菌KM71,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,Cecropin B获得表达,分子量约3.8KD,摇瓶发酵产率可达到200μg/mL,并对其抗菌活性进行了初步测定。结果表明我们表达的重组Cecropins B对G-菌有较好的抑菌活性,且具有较好的热稳定性。这些特点使得重组抗菌肽Cecropins B在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

野生革耳菌漆酶cDNA在巴斯德毕赤酵母中的表达

将分离到的野生革耳菌(Panusrudis)漆酶的cDNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建成受强启动子AOX1控制的重组表达载体.重组质粒DNA经BglII线性化后,电击转化毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选和PCR鉴定的重组酵母在甲醇诱导后能分泌表达活性漆酶.低温培养是该漆酶基因活性表达的必要条件.培养基中添加400μmol/L的CuSO4最有利于漆酶的活性表达.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.