从寄主昆虫血淋巴中分离纯化病原真菌菌体的方法

采用正交实验方法,对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化．在优化条件下,不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA和RNA。而且成功地分离和纯化了绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌体．裂解血细胞及其DNA和RNA的最佳酶解条件为：蛋白酶K的浓度为1mg／mL,作用温度为26℃,时间为60min,脱氧核糖核酸酶（DNAase I）的用量为5U,核糖核酸酶（RNAaseA）的浓度为0．5mg／mL,作用时间为35min,作用温度为30℃．以蝗虫特异引物进行PCR及RT-PCR检测结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离纯化无蝗虫DNA和RNA污染的绿僵菌菌体,为后续分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因,研究它们在致病机理中的作用奠定了基础．     

棉花病害拮抗菌SC-4鉴定及其抗菌物质分离纯化

从徐州工程学院周围多点取土样,筛选得到一株对多种细菌、真菌(尤其是引起棉花病害的真菌,如棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、棉铃红腐病菌)具有较好抑制作用的放线菌菌株,命名为SC-4.通过形态学、生理生化实验以及菌株16SrDNA序列分析,初步确定其为淡紫灰链霉菌类群中的灰褐链霉菌.通过硫酸铵沉淀获得样品,再经高效液相色谱分离,获得4个组分,其中组分2对棉花致病菌有较好的抑制作用.该研究对于新型生物农药的开发以及棉花病害生物防治具有一定意义.     

微量农药和大肠杆菌诱导蓖麻蚕产生抗菌物质的研究

用微量除虫菊酯类农药和大肠杆菌(E·coli)诱导蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricini)蛹后,其血淋巴经聚丙烯酰胺凝胶电泳测活和葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶层析分离后,在蛹血淋巴中至少可分离到4种具有抗菌活性的物质,3种为偏碱性的抗菌蛋白和抗菌多肽,1种为偏酸性的大分子抗菌蛋白。蓖麻蚕蛹免疫血淋巴中的抗菌物质以抗菌蛋白为主,其分子量为7万-7.5万和2.3万-2.4万道尔顿。两种小分子抗菌物质的含量较少,按其电泳位置推测,分子量为4000道尔顿左右。诱导前和诱导后3hr内注射放线菌素D均能抑制抗菌物质的合成。     

大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研究

探讨了从生活污水中分离、纯化大肠杆菌噬菌体的方法.经富集,从厦门大学、厦门港的生活污水中获得3种噬菌体.一是:蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体,其头部为二十面体,直径约110～120 nm,尾部长220～230 nm,尾宽13～15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构.二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体,其头部为三十面体,约70 nm×110 nm,尾部长约120～130 nm,尾宽约18～22 nm,有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构,该类噬菌体在污水中占绝大多数.三是短尾噬菌体,其头部为二十面体,大小为20 nm,尾部长约2～3 nm,在污水中占有一定的比例.2种噬菌体在-18℃冰箱可存活56天.经噬菌体处理的污水,总菌数下降了30%左右,大肠杆菌总数下降90%以上.     

人可溶性增殖诱导配体在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定

人增殖诱导配体在促肿瘤细胞增殖以及自身免疫性疾病中具有重要的作用．从GenBank中查出人APRIL的序列号（AR）46888）,根据其胞外可溶部分序列设计引物,采用RT-PCR技术从健康人新鲜血液单核细胞（PBMCs）总RNA中克隆出人sAPRIL cDNA,将该cDNA克隆人原核表达载体pET30a,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS—PAGE后在17000左右有一明显的表达条带,该蛋白主要以包涵体形式存在,表达量达45％左右,将包涵体蛋白变复性后进行细胞生物活性实验,为进一步研究其临床应用奠定了基础．     

重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

人脑钠素(hBNP,humanbrainnatriureticpeptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素.临床研究表明,hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物.化学合成脑钠素全基因,以pET32a为表达载体,构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin＿hBNP)融合蛋白表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25%以上.融合蛋白经肠激酶裂解、Zn＿Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析,从每升培养液中可获取4mgrhBNP,纯度达到95%.经质谱测定,rhBNP样品的分子量为3464Da.体外活性测定结果表明,rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应,其ED50为(2.24±0 58)×10-6mg/mL.     

猪凝血酶的分离纯化与鉴定

本文报导以猪血为材料，制备凝血酶，血浆在低离子强度下经等电沉淀得优球蛋白，从该沉淀中采用稀盐溶液提取，氢氧化镁吸附和二氧化碳解吸等步骤获得凝血酶原粗品。后者经脑提取液激活，再经乙醇分级、ＤＥＡＥ－纤维素与磷酸纤维素离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤，得凝血酶制品，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，制品呈单一条带，分子量约为３９ｋＤ，比活达１６１０ＮＩＨＵ／ｍｇ蛋白，以活化的粗品活性为１００％，活性回收率为４８％，纯化倍数约为１０。     

镉诱导大鲵肝脏与肠金属硫蛋白的分离纯化与鉴定

以两栖动物大鲵为材料，镉诱导金属硫蛋白（ＭＴ）合成，凝胶过滤ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０及弱阴离子交换ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ常压液相柱层析进行两次分离纯化肝脏及肠材料，分别得到两个ＭＴ亚型，凝胶过滤表观分子量约１２ｋＤ，半胱氨酸含量约２１％￣２４％，主要含Ｃｄ与Ｚｎ，Ｃｄ／Ｚｎ约为３／１，肝ＭＴ产率为６２８μｇ ＭＴ／ｇ鲜重肝，肠ＭＴ产率为１８５μｇＭＴ／ｇ鲜重肠，２５０ｎｍ     

家蚕抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分离纯化及性质鉴定

经大肠杆菌E．coli K12D31诱导后的家蚕幼虫，其免疫血淋巴经CM-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析及HPLC分离后，得到2种抗菌蛋白，经液相色谱-电喷雾质谱（ESI-MS）分析鉴定，纯化的2种抗菌蛋白分别是家蚕抗菌肽eeeropin D和溶菌酶lysozyme酸性电泳（A-PAGE）测活免疫血淋巴得到抗菌蛋白活性谱：cecropin D在8h无显著表达，12h有较强抗菌活性，30h达到最高，以后逐渐降低；lysozyme在8h后检测到表达，12h到达高峰，之后逐渐下降，48h的血淋巴中未检测到明显的表达．研究认为抗菌蛋白lysozyme和cecropin D是家蚕幼虫感染细菌8h后大量表达的抗菌蛋白，主要参与细菌感染12～30h的血淋巴对细菌的清除，是参与家蚕幼虫抗菌免疫的重要蛋白．     

真鲷卵黄蛋白原的诱导、纯化及初步鉴定

采用腹腔注射17β-雌二醇（E2），使真鲷雌鱼在一星期内产生大量卵黄蛋白原（Vtg）；利用阴离子交换高效液相色谱系统分离纯化E2诱导后的Vtg．Native-PAGE电泳结果表明。真鲷有两种形式的Vtg。分子量分别为570kDa和360kDa；SDS-PAGE电泳结果表明，它们由两个不同的亚基构成，分子量分别为180kDa和115kDa；磷、脂、糖蛋白分析证实，所获取的Vtg是一类含磷、脂、糖的大分子蛋白．同时考察了4-壬基酚（4-NP）对真鲷Vtg的诱导作用．     

家蝇幼虫抗菌物质的诱导及抗菌活性研究

针刺家蝇三龄幼虫诱导其体内产生抗菌物质,利用乙酸铵和硫酸铵盐析方法提取纯化家蝇三龄幼虫体内产生的抗菌物质,并进行抗菌实验,通过测量其抑菌圈的大小来确定其抑菌能力的强弱。实验结果显示:家蝇三龄幼虫经针刺诱导后能产生抗菌物质;经初步鉴定该抗菌物质为蛋白质或多肽,且具有热稳定性。     

宣威火腿中抗菌肽的分离、纯化及鉴定

为探究干腌火腿中生物活性多肽的抗菌活性及其组成,选取产自中国云南省曲靖地区的宣威火腿为材料,通过缓冲液浸提的方法提取火腿中的多肽成分。以粗提多肽对单增李斯特菌和O157型大肠杆菌的生长抑制情况为指标进行抗菌性评价,同时结合离子交换色谱、尺寸排阻色谱等技术对宣威火腿粗多肽进行分离与纯化,并选取其中抑菌活性较强的组分进行氨基酸序列测定。抑菌实验发现宣威火腿粗多肽具有显著抑制单增李斯特菌和O157型大肠杆菌生长的效果;经过逐级分离纯化得到的各组分具有不同的抑菌活性。其中组分7活性最强,对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌率分别为98%和56%。通过Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鉴定,最终得到抑菌活性较强的多肽序列,分别为QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK。将鉴定得到的3条多肽化学合成后进行抑菌实验发现,合成多肽均具有较好的抑菌效果,对O157型大肠杆菌的生长抑制效果均显著高于单增李斯特菌。研究结果表明宣威火腿中含有抑菌效果的肽类成分,从而为阐释宣威火腿多肽的功能特征提供理论依据。     

鸡源大肠杆菌分离鉴定与药敏试验

自成都市某养鸡场发生的疑似大肠杆菌病的病死鸡肝脏中无菌采取10份病料,分离鉴定出5株大肠杆菌,经O血清型鉴定,除一株未定型外,共鉴定出4株大肠杆菌的O血清型,分别是O37两株、O84和O100各一株．用18种抗菌药物进行药敏试验,分离菌株耐药性非常严重,以多重耐药为主,最少的耐药10种,最多的耐药17种,其中,对罗美沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、阿莫西林、氧氟沙星、恩诺沙星和复方新诺明100％耐药（5／5）：对甲氧苄啶、四环素和链霉素80％耐药（4／5）;对新霉素、庆大霉素、头孢氨苄、头孢拉定和头孢唑啉60％耐药（3／5）;对阿米卡星20％．耐药（1／5）．结果提示,同一鸡场的发病鸡群存在着多种血清型,耐药谱复杂,且没有一种抗生素对所分离的菌株全部敏感．     

海金沙多糖的分离纯化及抗菌活性

从海金沙中提取水溶性粗多糖,用Sevag法脱蛋白后,经DEAE-纤维素52柱层析和葡聚糖凝胶G-200柱层析可得到纯品,利用纸片法进行了抑菌实验.结果表明:海金沙多糖显示了不同程度的抗菌活性,对普通变形杆菌和稻瘟病病原菌有相对较强的抑制活性.     

细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究

本文对细辛(Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim)kitag)中多糖进行了分离纯化以及初步的免疫活性研究。沸水提取细辛粗多糖,经80%醇析、Sevag法脱蛋白、DEAE-纤维素离子交换层析对粗多糖进行纯化得多糖级分A-1.5-水、A-1.5-0.1M、A-1.5-0.3M、A-1.5-0.5M、A-4-水、A-4-0.3M,并对级分A-1.5-0.3M做了进一步的研究。经Sepharose CL-6B分子筛层析测定其分子量约为4万。高效液相色谱(HPLC)法测定其单糖组成为半乳糖醛酸(74.7%)、阿拉伯糖(9.7%)、木糖(7.1%),此外还有痕量的半乳糖、葡萄糖醛酸存在。说明A-1.5-0.3M是一种以酸性糖为主的杂多糖。淋巴细胞转化试验结果表明细辛多糖A-1.5-0.3M对小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖有明显的促进作用。     

细辛多糖的分离纯化与免疫活性研究

本文对细辛(Asarum heterotropoides Fr.Var.mandshuricum(Maxim) kitag)中多糖进行了分离纯化以及初步的免疫活性研究.沸水提取细辛粗多糖,经80%醇析、Sevag法脱蛋白、DEAE-纤维素离子交换层析对粗多糖进行纯化得多糖级分A-1.5-水、A-1.5-0.1M、A-1.5-0.3M、A-1.5-0.5M、A-4-水、A-4-0.3M,并对级分A-1.5-0.3M做了进一步的研究.经Sepharose CL-6B分子筛层析测定其分子量约为4万.高效液相色谱(HPLC)法测定其单糖组成为半乳糖醛酸(74.7%)、阿拉伯糖(9.7%)、木糖(7.1%),此外还有痕量的半乳糖、葡萄糖醛酸存在.说明A-1.5-0.3M是一种以酸性糖为主的杂多糖.淋巴细胞转化试验结果表明细辛多糖A-1.5-0.3M对小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖有明显的促进作用.     

大鼠骨髓间质干细胞的分离纯化与鉴定

采用密度梯度离心法分离骨髓间质干细胞,差速贴壁法进行纯化,应用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等对纯化细胞进行鉴定,结果细胞表面抗原CD２９,CD４４,CD１０５,CD１６６表达呈阳性,而CD１４,CD３４,CD４５表达呈阴性。采用RT唱PCR鉴定了三个基因：nestin,NST,Oct唱４,前两者呈阳性表达,后者弱阳性表达。这些细胞特异抗原与基因表达综合起来,表明得到的细胞具备骨髓间质干细胞的特性。密度梯度分离与差速贴壁相结合,可获得较好均一性的骨髓间质干细胞,是一种简单可靠、易于推广的骨髓干细胞获取方法,可为细胞与组织工程研究提供种子细胞。     

2种弧菌鞭毛蛋白的分离纯化与鉴定

尝试分离提取2种弧菌的鞭毛蛋白,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对所提蛋白进行分离纯化,Western免疫印迹检测,电镜鉴定。结果显示：实验已经成功分离提纯了哈维氏弧菌的鞭毛蛋白,获得了溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液。提纯的哈维氏弧菌鞭毛蛋白经SDS-PAGE显示3条清晰蛋白带（相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa）,透射电镜观察表明该蛋白呈经典的丝状,可以认为哈维氏弧菌的鞭毛丝是由相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa的3种鞭毛蛋白亚基构成。溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液经SDS-PAGE后显示5-9条蛋白带,其中36.8KDa的蛋白带有强的免疫原性。     

家蝇抗菌物质的物理诱导方法研究

报道了超声波和高频电磁场诱导家蝇产生抗菌生物的方法及抗菌物质活性与诱导方法的关系。结果表明：超声波和高电磁场均可诱导家蝇产生抗菌物质，但活力高峰出现的时间不同；诱导强度对诱导效果有影响。     

血清白蛋白的分离纯化及鉴定

由新鲜驴血浆离心得到的血清经冷冻,离心,透析,0.22μm滤膜过滤,经过两步Source 15Q离子交换色谱于HPLC进行纯化,得到3个含有驴血清白蛋白的峰.经SDS-PAGE电泳测定,其分子量在66.0 kDa左右,纯度达到电泳纯.经PAGE电泳鉴定,均为单一驴血清白蛋白.此法步骤简单,用血量少,适用于实验室常规分析和研究.