水稻黑条矮缩病毒基因组组分10编码的外壳蛋白基因的克隆及表达

从我国山东发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒 ,抽提病毒RNA ,经RT PCR ,克隆了编码外层外壳蛋白的基因组组分 10 (S10 )的cDNA ,并进行了序列测定 .与已报道的日本株和湖北等地的S10进行了序列同源性比较 .结果表明 ,与日本株的同源性为 92 % ,与湖北等地的同源性在 97%～ 98%之间 .将该序列构建到pGEX 3X表达载体中 ,经IPTG诱导 ,表达了分子质量约为 76ku的GST融合蛋白 .经亲和层析纯化和Western印迹分析 ,证实了该基因以可溶性的GST融合蛋白形式在原核中表达 .     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

水稻黑条矮缩病毒基因组第九组分cDNA的克隆及序列分析

从我国发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒,抽提病毒RNA,利用RT-PCR等手段,获得了病毒基因组第九组分（S9）cDNA克隆。序列分析结果表明：S9全长1900bp,含有2个不重叠的ORF,编码蛋白的分子质量分别为39.9,24.2ku,与日本株S9核苷酸序列同源性为89%,与意大利株MRDV S8同源性为86%。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列。设计了一对引物并以RT-PCR特异性扩增出IBV H52疫苗株的S1基因，基因产物大小为1．62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与其他标准毒株H120，M4l，BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，H52株与H120，M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为91．1％，96．9％和96．8％，由此可以看出，IBVH52疫苗株与标准毒株在Sl基因上具有高度的同源性。     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆,序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株（ＰＲＶ ＨＢ株）糖蛋白Ｈ基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析，比较了该序列与ＰＲＶ Ｋａ株及ＮＩＡ－３株三之间的同源性。结果显示，克隆片段长１３９６ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量７５．６％包括糖蛋白Ｈ（ｇＨ）Ｎ端２８３个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶端１３     

NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化

为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.     

SARS相关冠状病毒及与动物冠状病毒的关系

比较了6株人、5株禽、4株鼠、7株牛、2株猫、9株猪、4株犬和5株人非典型肺炎共42株冠状病毒S糖蛋白基因序列。DNAstar软件比较表明，人冠状病毒S基因核苷酸序列同源性介于27．2％～99．5％；禽的介于81．5％～100％；鼠的介于79．5％～89．6％；牛的介于97．7％～100％；猫的介于56．2％～93．9％；猪的介于54．8％～100％；犬的介于64．9％～98．8％；人非典型肺炎病毒的介于99．9％～100％。非典型肺炎冠状病毒与所有比较的42株序列的同源性均低于30．8％，预示该病毒似乎不是其它病毒株变异进化的结果，而是人类和畜禽从未接触过的一种新型病毒。     

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mt coⅠ)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明coⅠ基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株coⅠ基因与其他地理株具有较高的同源性.     

鸡传染性支气管炎病毒M41及疫苗株H52,H120 S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计了一对引物并以RT—PCR特异性扩增出IBV标准强毒株M41和疫苗株H52,H120的S1基因,基因产物大小为1．62kb,与预期相符,对其测定序列后,同源性比较显示M41株与H52,H120的核苷酸序列的同源性分别为99．2％和97．1％,推导的氨基酸序列的同源性分别为98．3％和95．4％,该结果表明IBV M41与疫苗株H52,H120在S1基因上具有高度的同源性。     

一种非洲番茄黄化曲叶病毒DNA的克隆

用ＰＣＲ获得了非洲塞内加尔番茄黄化曲叶病毒（ＴＹＬＣＶ－ＳＥＮ）的全长ＤＮＡＡ，并进行了克隆和部分序列分析，ＤＮＡ序列分析的序列并１３５９ｂｐ，包括外壳蛋白基因，ＡＶ１基因，基因间区（ＩＲ）及部分复制酶基因，计算机分析显示：ＴＹＬＣＶ－ＳＥＮ与其他亚组ＩＩＩ及生理病毒相比，外壳蛋白氨基酸同源性为６７％～８３．４％，ＡＶ１基物氨基酸同源性为６１％～８４％，ＩＲ最大同源性为６０％～６８％，且与非洲和中     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

与酵母Ure2p朊病毒结构域融合表达的谷胱苷肽—S—转移酶结构的改变

酵母朊蛋白Ure2蛋白（Ure2p）具有动物朊蛋白类似的构象转变特点,其N－端65个氨基酸是朊病毒结构域（PrD）,对酵母朊病毒的发生起关键性作用,将PrD基因与谷胱苷肽－S－转移酶（GST）基因重组,在大肠杆菌中表达了可溶性的GST－PrD融合蛋白（sGST-PrD）,sGST-PrD在体外自发地聚合成纤维,这种蛋白纤维的圆二色谱呈典型的β－折叠,对蛋白酶K的抵抗力增加,并具有淀粉样纤维的光学特性,聚合的GST－PrD（aGST-PrD）能促进sGST-PrD聚合成纤维,这些结果显示PrD能使与其融合的GST蛋白的构象发生变化,形成一种新的朊蛋白样嵌合蛋白,这是PrD改变其他蛋白构象的证据。     

高浓度c—Myc羧基端的体外自身二聚体化活性

将编码人c-myc羧基端bHLH／LZ结构域的92个氨基酸的cDNA片段（c-myc-c92）对框插入pGEX－2T原核表达载体中,使之与谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因融合,并将重质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,由IPTG诱导融合基因高效表达,并用Glutathione Sepharose4B亲和柱纯化融合蛋白GST－c-Myc-c92,凝胶阻滞（EMSA）分析显示该纯化蛋白能与CACGTG序列特异结合,并且只有高浓度的GST－c-Myc-c92才能与探针结合,结果表明在体上情况下高浓度c-Myc羟基端能自身二聚体化,此发现丰富了Myc-Max-Mad的调控网络,并为进一步研究c-myc的功能和调控提供了一定的线索。     

2株甲型肝炎病毒蛋白酶2A核苷酸序列的测定与比较

从甲型肝炎病毒２个不同株感染的ＫＭＢ１７细胞中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ特异性扩增出此２毒株病毒蛋白２Ａ基因,将２个２Ａ基因克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定,得到２个２Ａ基因的核心苷酸序列,序列比较发现它们及与ＨＡＶ野毒株相对应序列有突变存在,Ｈ２株与ＨＭ１７５相比有一个点突变,同源性为９９．７２％;与ＨＭ１７５比较,Ｈ２株和Ｌ８株第３１９７位核苷酸均由Ａ突变为Ｇ,相应的氨基酸由丝氨酸     

一株野生鹧鸪源冠状病毒主要结构基因进化特性分析

从野生禽类鹧鸪的喉气管拭子中分离到1株冠状病毒，命名为Partridge/GD/S14/2003（简写为S14）.通过RT-PCR扩增、克隆测序获得了该毒株的全基因组序列（AY646283），序列经DNAstar分析发现，S14毒株与肾型毒株JX1-99，TJ2-96 S1基因同源性最高，分别达到94.6%和93.4%，并且该毒株的S1基因还和QXIBV，LX4株也存在高度亲缘性，分别达到85%和84.3%，同时对S14 S1基因BLAST时发现只有上述毒株和S14有高度同源.由此推测该鹧鸪分离株S14的进化可能与IBV肾型和腺胃型病毒存在一定关系.序列分析表明，S14毒株与GenBank中注册序列QXIBV，LX4的S2基因同源性最高分别达到97.2%和90.6%，都处于Ⅱ群.M基因系统进化树研究发现，S14处于Ⅲ群，与SAIB20，GD698同源性最高，分别达到90.6%和90.2%；而与其S1，S2基因同源较高的BJ，QXIBV株，M基因的进化关系却较远.N基因同源性和系统进化树分析发现，Ⅰ群毒株可能为H52和Gray株发生重组的结果，Ⅱ群毒株可能为H120和D1466等毒株重组的结果，而S14株处于Ⅲ群，其N基因与QXIBV高度同源，达到95.7%，Ⅳ群为肾型分离株.而与其M基因亲缘性最近的SAIB20，GD698则分处Ⅰ，Ⅳ进化群.     

母婴配对血清中TT病毒的分子鉴定

为了解TT病毒（TTV）在我国母婴间传播的可能及分子病毒学依据，合成引物（引物1：5′－ACAGACAGAGGAGAAGGCAACATG－3′；引物2：5′－CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT－3′；引物3；5′－GGCAACATGTTATGGATAGACTGG－3′），采用半套式聚合酶链反应（hemi-nested PCR）方法，检测了40对母、婴母对血清中的TTV DNA，并对TTV DNA均阳性的一对母婴配对血清中PCR产物进行测序和序列分析，结果发现：（1）在40例产妇血清中，有5例经半套式PCR检出了TTV DNA，检出率为12.5%；40例脐血中，检出TTV DNA阳性血清1例，阳性率为2.5%，脐血呈阳性的新生儿母亲静脉血中TTV DNA也为阳性。（2）母婴同时检出TTV DNA的血清PCR产物经测序后进行序列比对，二者病毒核苷酸序列的同源性为1005；与日本G2b型代表株核苷酸同源性为98.6%，属于G2b亚型，研究结果表明：TTV存在母婴传播途径，TTV可经胎盘垂直传播。     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。