仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。     

啮齿类实验动物唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光定量PCR方法的建立及应用

目的 建立用于检测实验动物小鼠中唐菖蒲伯克霍尔德菌的荧光定量PCR方法。方法 参考团标公布的序列合成唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引物、探针和质粒，建立荧光PCR方法，并对方法的线性、灵敏度、重复性和特异性等性能进行验证。同时应用建立的荧光PCR方法和细菌培养法对110份小鼠送检样品进行比对检测。结果 建立的唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光PCR方法，相关系数R²可达0.998,线性良好；方法最低可检测至1×10² copies/5μL,灵敏度高；方法检测培养的唐菖蒲伯克霍尔德菌为阳性，检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌均为阴性，特异性良好。采集110只安乐死小鼠样品，分别进行细菌培养和荧光PCR检测，结果均为阴性，2种方法结果完全符合。结论 建立的荧光PCR方法性能良好，可用于实验动物小鼠唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测。     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立一种适用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR检测方法。方法 根据泰泽病原体的16S rRNA序列设计了特异性的引物和探针,对引物和探针浓度进行了优化,并评价其敏感性、特异性和重复性。同时,使用该方法对临床样品进行了检测,并与已报道的套式PCR方法进行比较。结果 建立了能够特异检测泰泽病原体的实时荧光PCR检测方法,该方法检测质粒标准品的最低检测限为8 copies/μL,不与SPF级实验动物必须排除的多种细菌发生交叉反应,批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对70份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法。结论 建立的实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,适用于兔粪球样本中泰泽病原体的检测。     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

封闭群长爪沙鼠遗传标准的建立

目的 建立封闭群长爪沙鼠遗传质量标准和遗传质量检测方法。方法根据群体遗传学理论,参照实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制（GBl4923—2001）,在查阅大量文献资料的基础上,建立封闭群长爪沙鼠遗传标准。检测方法采用微卫星标记分析技术。从GeneBank中挑选出的536个小鼠微卫星位点对长爪沙鼠基因组DNA进行PCR扩增得到135个长爪沙鼠微卫星,并优化PCR扩增条件,通过琼脂糖电泳和STR扫描二级筛选,根据位点在染色体分布情况、等位基因数目和多态性等优化出适于封闭群长爪沙鼠遗传检测的微卫星位点组合,建立检测方法。结果初步建立了封闭群长爪沙鼠遗传质量标准和检测方法。     

鼠脑心肌炎病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立快速诊断鼠脑心肌炎病毒感染的荧光定量RT-PCR方法。方法根据鼠脑心肌炎病毒(EMV)PEC9毒株全基因组序列(Gen Bank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果建立的荧光定量PCR方法,标准曲线的线性关系良好,r2值可达0.99,敏感性最低检测限为1个拷贝数,高于普通PCR方法 1000倍,其特异性强,与其他常见感染的小鼠病毒株均无特异性扩增,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠心肌样品进行检测,未检测到阳性感染。结论本研究为鼠脑心肌炎病毒感染的分子检测,为制定国家标准提供良好的方法。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）定量检测方法，根据TaqMan探针荧光定量分析原理，对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助，对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选，利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化，其最佳浓度分别为4．5mmol／L，400nmol／L和500nmol／L．同时，对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估，最低检出量为10^2个拷贝数的质粒，特异性为100％，CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测，结果全为阴性．试验表明，所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析，从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法的建立与应用

摘要: 目的建立长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法,用于长爪沙鼠体内仙台病毒抗体的检测。方法孵育鸡胚,接种SeV,制备鸡胚尿囊液正常抗原和SeV 特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、精密性、稳定性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0. 1 μg /mL、2 μg /mL 和1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为9. 6% 和8. 4%,批间平均变异系数分别为9. 0% 和5. 9%; 检测灵敏度为1∶ 10 240; 与沙鼠小鼠肝炎病毒( MHV) 、小鼠肺炎( PVM) 、呼肠孤病毒3 型( Reo3) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA 方法特异性、敏感性强,重复性、稳定性好,检测结果,准确、可靠。可用于长爪沙鼠体内SeV 抗体的检测。     

鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 快速检测方法的建立与应用研究

摘要: 目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA 基因设计特异性引物和探针,构建含有HA 基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN 线性范围达10 个数量级( 100—109 拷贝) ,最低检测限度为4 拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCＲ 和测序进行确证。整个检测过程可在2 h 内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

人博卡病毒微滴数字PCR定量方法的建立

为准确、快速地从临床鼻咽拭子样本中筛选出人博卡病毒(HBoV)感染的阳性样本,以HBoV-sh9基因的保守区序列为检测靶标合成引物和探针,建立了微滴数字PCR(dd PCR)检测HBoV的方法.结果表明:HBoV dd PCR方法具有较高的特异性,在(0.5~6.8)×10~3copies/μL HBoV DNA浓度范围内,具有良好的线性和精确度,定量限低至0.5 copies/μL.182份临床样本检测结果显示:HBoV感染的阳性率为8.24%.此建立的HBoV dd PCR方法在定量限、准确性和重复性上较常规PCR优势明显,不受样品基质和扩增效率的影响.     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL^-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.