弓形虫快速鉴定及国内实验动物感染调查

目的 建立弓形虫快速鉴定方法,进行国内实验动物感染调查,为国家标准的修订提供参考依据。方法 选择2012年12月至2016年12月期间全国60个不同厂家的12 394只实验动物（包括：猴290只、小型猪425只、犬579只、兔1 234只、地鼠372只、豚鼠1 363只、大鼠987只、小鼠7 144只）作为调查对象。采用ELISA方法检测动物血清中弓形虫抗体IgG和循环抗原CAg。利用PCR技术鉴定弓形虫p30基因。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术识别弓形虫虫体。结果 用ELISA从12 394份动物血清中检出4份弓形虫抗体IgG阳性。在这4份抗体IgG阳性样本中都发现了弓形虫虫体和DNA。通过PCR扩增p30基因的分子特性证明了样本中弓形虫病原体的存在。通过直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,在这些样本中发现了弓形虫速殖子。2012年12月至2016年12月期间,对12 394只实验动物调查结果显示,弓形虫感染率为0.03%（4/12 394）。结论 ELISA、PCR、直接镜检实时动态显微视屏摄录技术相结合可完成实验动物的弓形虫检验工作。国内实验动物中存在弓形虫感染。因此,建议设计合理的筛查程序用于防止动物传播的弓形虫病。有必要开发新的诊断工具,特别是快检技术用于这一重要人兽共患病的未来研究。     

鸡双梳羽管螨(Syringophilus bipectinatus)的生物学研究

鸡双梳羽管螨寄生在鸡的羽管里面,其卵、前期若虫、后期若虫、成虫都在羽管内发现.它寄生在鸡的初级飞羽、次级飞羽、三级飞羽、初级复羽、次级复羽、小翼羽、尾羽、尾部复羽.雌成虫是羽管螨的传播阶段,它从鸡羽管的上脐部分出来,进入新生羽毛未封闭的上脐,又在其中生长、发育、繁殖.雏鸡的稚羽是从成年鸡身上出来的雌成螨侵入的第一套羽毛,稚羽一般感染不厉害,只初级复羽和次级飞羽有些感染,而到第一期婚羽,感染则急剧扩大,上述八种羽毛均可严重感染.雌成螨在雏羽中的第一次发现是在雏鸡孵出后35—42天,鸡双梳羽管螨生活史如下:雌成虫(?)卵(?)幼虫(?)前期若虫(?)后期若虫(?)雌成虫(?)卵(?)幼虫(?)前期若虫(?)后期若虫(?)雌成虫或雄成虫.鸡双梳羽管螨传播仅发生在鸡的孵雏和脱毛期.     

应用伊维菌素驱杀实验动物体内外寄生虫

目的寻找一种安全有效的驱杀实验动物体内外寄生虫的药物。方法将携带鼠癣螨雄性小鼠随机分为3组,雌鼠也随机分为3组;将携带鼠隐匿管状线虫卵雄性小鼠随机分为3组,雌鼠也随机分为3组。通过3周饮用浓度分别为0.1%、0.5%和1.0%的伊维菌素来观察驱杀效果。结果 3个浓度的伊维菌素对实验动物鼠癣螨和鼠隐匿管状线虫均有较好的驱杀效果。结论伊维菌素可作为一种安全有效驱杀实验动物体内外寄生虫的药物使用。     

黑胸大蠊免疫兔血清的制备与应用

按常规动物免疫方法用黑胸大蠊不同发育阶段可溶性抗原对新西兰兔进行免疫,并通过SDS-PAGE和酶联免疫印迹(EL IB) 技术分析黑胸大蠊不同发育阶段抗原的免疫学特性,同时用黑胸大蠊若虫和雄虫免疫兔血清筛选美洲大蠊若虫cDNA 文库,对阳性克隆进行PCR 鉴定和序列测定,结果显示：卵抗原、若虫抗原、雄成虫抗原、雌成虫抗原分别可见13,28,26 和41 条蛋白区带,4种抗原组分相互之间有交叉抗原存在,用黑胸大蠊若虫免疫兔血清筛选出1个新基因,用黑胸大蠊雄虫免疫兔血清筛选出6个新基因.     

2013 年昆明地区实验用小鼠及豚鼠寄生虫及病毒感染情况调查

摘要: 目的 分别调查昆明市三家单位提供的共 90 只实验用 ICR 小鼠和 45 只实验用豚鼠的体内、外寄生虫感染 情况,以及小鼠及豚鼠仙台病毒(SeV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、豚鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎(LCMV) 的感染情况, 为实验动物质量管理提供一定的参考依据。方法 根据现行国家标准所描述的方法及病毒检测试剂盒说明书的 说明,对昆明市三家单位随机提供的共 90 只 ICR 小鼠和 45 只豚鼠样本,分别进行体内、外寄生虫、小鼠 MHV 及小 鼠 SeV、豚鼠 LCMV 及豚鼠 SeV 的检测。结果 昆明地区实验用小鼠及实验用豚鼠均检出体内、外寄生虫;3 只小 鼠检测出体外寄生虫,检出率为 3. 3% ;20 只小鼠检测出体内寄生虫卵,检出率为 22. 2% ; 4 只豚鼠检测出体外寄 生虫,检出率为 8. 9% ;9 只豚鼠检测出体内寄生虫卵,检出率为 20. 0% ;小鼠 MHV 及 SeV 血清学检测无阳性; 豚 鼠 LCMV、SeV 血清学检测无阳性。结论 实验动物质量监测是实验动物质量控制的有效手段,对医学及生命科学 的研究至关重要,昆明地区实验动物的寄生虫质量控制有待加强。     

利用细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因鉴定宠物仓鼠

为探究DNA条形码技术在商品宠物仓鼠的品系鉴定中的可行性,以金丝熊、虎纹熊、眼圈熊、奶牛熊、银狐、紫仓、奶茶、布丁、老婆婆共9个品系36只宠物仓鼠为动物材料,无损取材后,提取基因组DNA,利用特异性引物对线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行PCR扩增测序,通过遗传距离和系统进化分析鉴定仓鼠的物种分类.结果显示:1)36个样本均成功扩增出长度为750bp左右的COⅠ基因片段;2)宠物仓鼠中的熊类均属于中仓鼠属(Mesocricetus)物种,其他品系则分属于毛足鼠属(Phodopus)和仓鼠属(Cricetulus)的4个物种,各品系之间谱系混乱.本研究认为,COⅠ基因是适宜于物种鉴定的分子标记,但对宠物仓鼠品系的鉴定和区分能力不足.     

野生滇西亚种树鼩体内外寄生虫感染及其致病性的分析

目的调查分析野生滇西亚种树鼩体内外寄生虫感染种类及特征,分析其可能对动物的致病性,为人工饲养树鼩的质量控制和保护树鼩群体提供科学依据。方法随机选取200只野生滇西亚种树鼩,分别用活体漂浮法和直接拔毛法制片,置于体视镜和显微镜下鉴定体外寄生虫种类;体内寄生虫分别采用粪便漂浮法和粪便沉淀法进行检测,并在显微镜下鉴定。结果野生滇西亚种树鼩体外寄生虫感染率分别为虱20.5%、蚤5.5%、螨3.0%、颗粒硬蜱1.0%、黄蛛甲1%、圆胸皮蠹1%、水蛭1%、蛛甲0.5%;体内寄生虫感染率分别为线虫14%、线虫卵33%、绦虫9%、绦虫卵20%、变形虫2%。结论野生滇西亚种树鼩体内外寄生虫的自然感染种类繁多,对树鼩群体的影响不可低估,应该引起重视。     

于氏纤恙螨在云南省部分地区的分布及宿主选择

目的:对于氏纤恙螨在云南省部分地区的分布和宿主选择情况进行初步探讨。方法:结合云南省不同地理方位和地形,独特的气候与生态等特点,于2001年—2011年选取了23个县(市)进行野外调查,用鼠笼(夹)加食饵诱捕鼠类等小型哺乳动物(小兽)宿主。选择小兽的双侧耳廓和外耳道采集恙螨幼虫,用霍氏液常规封片后在显微镜下逐一鉴定螨种。统计于氏纤恙螨在不同地域、不同景观和不同宿主小兽体表的分布情况。计算于氏纤恙螨在不同宿主小兽体表的感染率(P)、平均多度(MA)和感染度(MI),用聚块指数(m*/m)测定其在宿主不同个体间的空间分布格局。结果:所调查的23个县(市)中,有9个县(市)采集到了于氏纤恙螨(共1 959只,占所有恙螨的1.81%)。88.77%的于氏纤恙螨采自山区地理景观(尤其是海拔较高地区),只有11.23%的于氏纤恙螨采自坝区景观。宿主大类选择显示,采自啮齿目(鼠类)、攀鼩目(树鼩)和食肉目小兽体表的于氏纤恙螨分别为57.78%、42.16%和0.05%,其它目小兽体表没有采集到该螨。宿主种类选择显示,所捕获的5目12科34属67种小兽中,有20种小兽采集到了于氏纤恙螨,其中42.16%采自攀鼩目树鼩科树鼩属的树鼩,其感染率(26.52%)和感染度(13.54只螨/每兽)均比较高,其次是其他野栖小兽。聚块指数显示,于氏纤恙螨在大多数宿主小兽不同个体间的分布呈聚集分布格局。结论:云南省存在于氏纤恙螨,且数量较大。该螨主要分布在海拔较高的山区地带,可寄生多种小兽宿主,宿主特异性低,但主要倾向于寄生在树鼩等野栖小兽体表。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

小鼠腺病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。     

两株小鼠诺如病毒的分离与鉴定

摘要: 目的了解江苏地区常用实验小鼠诺如病毒( murine norovirus,MNV) 的感染情况及进化特征。方法在江苏地区抽取三个实验动物中心的实验小鼠,采集直肠及内容物样本,应用ＲT-PCＲ 方法检测MNV OＲF2 特异性基因( 547bp,MNV nt5104-5650) 。阳性样本经ＲAW264. 7 细胞分离病毒,对MNV 分离株的VP1 基因进行扩增,将其连接在pEASY-Blunt 载体上,转化至大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞,通过Kanamycin 抗性筛选,挑取菌落进行PCＲ鉴定,鉴定为阳性的克隆送检测定其VP1 基因序列,构建系统发生进化树。结果共检测小鼠直肠内容物30 份,检出MNV 阳性样本4 份,包括ICＲ 小鼠( 2 /8) 、BALB/c 小鼠( 1 /12) 和C57BL/6J 小鼠( 1 /10) ,感染率为13. 3%;ＲAW264. 7 细胞接毒盲传三代,两只ICＲ 小鼠样品接种的细胞产生明显细胞病变( CPE) ,表现为细胞圆缩聚集,大部分脱落死亡,而C57BL/6J 和BALB/c 小鼠样本接种ＲAW264. 7 细胞无CPE; 应用VP1 特异引物经ＲT-PCＲ 检测,表现CPE 的细胞样本出现特异条带,测序结果显示分离到的2 株MNVVP1 核酸序列均为1626bp,与引物设计参考毒株S7-P2( GenBank 登录号: AB435514) VP1 基因大小相同,进化树图表显示检测到的2 株MNV 属同一独立小分支与参考株BJ10-2062、CＲ4 最为相近。结论此次抽检的实验小鼠MNV 感染率为13. 3% ( 4 /30) ,考虑可能在同一设施内传播。常用实验小鼠携带病毒的生物学意义有待进一步研究。