去除信号肽有利鸡白细胞介素-10在哺乳动物细胞胞浆的表达

目的分析鸡白细胞介素10(chicken interleukin-10,chIL-10)的信号肽对体外表达的影响,以获得稳定表达chIL-10的细胞系。方法采用RT-PCR方法从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中分别扩增含信号肽(euchIL-10F)和去信号肽(euchIL-10M)的chIL-10编码基因,克隆入含有报告基因e GFP和新霉素抗性基因(neo)的真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒N1-euchIL-10F和N1-euchIL-10M。分别转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1),经G418加压筛选、纯化,获得稳定表达chIL-10蛋白的CHO-K1细胞系,利用激光共聚焦试验观察外源蛋白的细胞定位。结果通过RT-PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验,表明euchIL-10F和euchIL-10M均整合入细胞基因组中,且N1-euchIL-10M在胞浆大量表达较强的绿色荧光,而N1-euchIL-10F表达的荧光较弱,且胞浆内含量很低。结论去除信号肽利于chIL-10基因在体外真核细胞胞浆的表达。     

B19 单倍型鸡 BNK 蛋白单克隆抗体的制备

摘要: 目的 体外构建稳定表达鸡自然杀伤细胞( Natural killer,NK) BNK 蛋白的细胞系,制备 BNK 蛋白的单克隆抗体,为鸡 BNK 蛋白及 NK 细胞的研究提供便利。方法 利用 BNK19 原核表达产物免疫 BALB/c 小鼠,体外稳定表达疫病敏感性 B19 单倍型鸡 BNK 蛋白( BNK19) 的真核细胞系筛选单克隆抗体。结果 用稳定表达 BNK 蛋白的真核细胞系筛选到 2 株 BNK19 特异性单克隆抗体。结论 获得的单克隆抗体经鉴定具有免疫学活性,为鸡 BNK 蛋白及 NK 细胞的作用机制研究提供了条件。     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

中国明对虾CrusFc-2基因的重组表达及抗血清制备

利用PCR和DNA重组技术克隆了中国明对虾CrusFc-2基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-CrusFc-2原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到了重组蛋白.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,Western Blot分析表明Crus...     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的表达分析及多克隆抗体制备

为进一步开展草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的生物学功能研究准备实验材料,同时探讨并构建一种草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法。实验构建了VP38的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG (Isopropylβ?D-Thiogalactoside)诱导表达,8mol/L尿素溶解重组蛋白后免疫小鼠,制备鼠抗VP38多克隆抗体;利用制备的抗体探究Grass carp reovirus-104(GCRV-104)感染后VP38在翻译水平的表达动力学;利用Western blot、间接免疫荧光分析(IFA)对抗体进行评估;构建VP38的真核表达载体pEGFP-N1-VP38,转染至草鱼性腺(Grass carp ovary,GCO)细胞内进行亚细胞定位分析。结果显示:重组VP38蛋白在原核表达系统中以包涵体形式存在;制备的鼠抗VP38多克隆抗体既能够识别重组VP38蛋白,也能够识别GCO细胞感染GCRV-104后表达的VP38蛋白;GCRV-104感染后72hVP38主要分布在细胞质中,与亚细胞定位结果一致;VP38在感染的前期微量表达,感染中后期大量表达。本研究制备的鼠抗VP38多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性,为构建草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法提供了较好的技术路线。     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.     

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

中国明对虾ALFFc基因的原核表达与抗血清制备

利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术克隆了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗脂多糖因子(ALFFc)基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)筛选法获得了1株高表达量重组菌,并通过实验确定其最佳诱导条件为:菌液初始OD6000.7,IPTG终浓度0.8 mmol/L,培养温度37℃,诱导时间3 h.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,为进一步研究ALFFc的功能奠定了基础.     

人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-Myc-SFN,并观察其在真核细胞中的表达。方法：通过反转录-聚合酶链反应从HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）中获得编码14-3-3σ的cDNA,定向克隆至真核表达载体pCMV-Myc中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内14-3-3σ的表达。结果：构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,将其转染HeLa细胞48h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内14-3-3σ的表达显著增高。结论：成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,为研究14-3-3σ在上皮细胞源性肿瘤中的作用奠定了基础。     

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备

目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.     

鼠白细胞介素15真核表达质粒的构建及活性鉴定

从经PMA刺激的小鼠脾细胞中提取总RNA, 采用RT-PCR技术获得鼠白细胞介素15(mIL-15)基因, 将其克隆至真核表达质粒VR1012中, 转染COS-7细胞, 将转染细胞裂解, Western blot检测. 表明获得了mIL-15真核表达载体, 其具有完整的带有信号肽的mIL-15序列, 重组结果正确, Western blot检测阳性. 并获得有生物活性的mIL-15蛋白.     

DJ-1真核表达载体构建及其转染口腔癌细胞的表达

目的:构建人DJ-1真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并转染人口腔癌细胞系Tca8113,建立含有DJ-1真核表达载体的口腔癌细胞模型。方法:以人HEK293细胞为模板,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增人DJ-1基因全长,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,经酶切鉴定和测序分析后,通过脂质体介导法转染人口腔癌细胞系Tca8113,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)和未转染组,最后采用RT-PCR法检测Tca8113细胞中DJ-1基因的表达情况。结果:RT-PCR法获得长度为500 bp左右的阳性产物,重组质粒后经酶切鉴定和序列分析证实真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1构建成功。转染Tca8113细胞后RT-PCR法证实与空质粒组和未转染组相比,转染真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1的细胞系中DJ-1基因表达明显增高。结论:成功构建人真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并建立含有该载体的口腔癌细胞模型,为进一步研究DJ-1基因在口腔癌中的功能及应用DJ-1进行基因治疗奠定基础。