FSH受体抑制剂对卵巢发育及FSHR和ERβ表达水平研究

目的:研究卵泡雌激素(FSH)受体结合抑制剂(FRBI)对卵巢组织中FSH受体(FSHR)和雌激素受体β(ERβ)基因和蛋白表达水平的作用,并探究FRBI是否通过调控FSHR和ERβ的表达来抑制卵巢癌的发生.方法:将180只雌性小鼠随机分为对照组(CG)、FSH组和实验组.实验组又分为4个小组(n=30),分别注射不同...     

雌激素受体β调控髓鞘损伤后少突胶质细胞发育的作用机制

性别是影响少突胶质细胞(OLs)发育的因素之一,雌激素受体β(ERβ)可能参与了OLs的发育调控,但其作用机制尚未明确.为阐明ERβ如何调控OLs的发育,通过在原代培养的少突胶质细胞前体细胞(OPCs)中过表达相关基因,使用溶血性磷脂酰胆碱(LPC)诱导OLs损伤以及荧光素酶报告基因等方法,考察了OPCs中ERβ如何调节细胞的分化以及ERβ受到哪些因素的调控.结果显示:过表达ERβ基因能够促进OPCs分化;LPC诱导损伤后,少突胶质细胞转录因子-2(Olig2)基因与ERβ的表达水平呈负相关,且过表达Olig2能够抑制OPCs中ERβ的表达水平;同时,LPC处理可诱导miRNA mmu-miR-219-2的表达,且mmu-miR-219-2能够直接与ERβ基因的3’-非翻译区结合并抑制其表达;而ERβ则通过与G蛋白偶联受体17(Gpr17)基因的启动子结合抑制Gpr17基因的表达,从而促进OPCs的成熟.综上,Olig2/mmu-miR-219-2/ERβ/Gpr17这一调控通路可能参与了OLs发育过程的调控,有望为临床上脱髓鞘疾病的治疗提供新的靶点.     

P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

Cu~(2+)诱导的Aβ_(40)种子的特性及其对Aβ_(40)聚集的影响

淀粉样β蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的二次成核机制认为Aβ聚集体可作为种子加速Aβ聚集.而Cu~(2+)与Aβ结合也会加剧Aβ聚集,因此了解Cu~(2+)诱导的Aβ种子对Aβ二次成核的影响具有重要意义.本文考察了不同浓度Cu~(2+)诱导的Aβ_(40)种子对Aβ_(40)聚集过程、聚集体形貌、二级结构以及细胞毒性的影响.结果表明,随着Cu~(2+)浓度增加,Aβ_(40)种子形貌由纤维状转变为球形.并且,两种形貌的Aβ_(40)种子均可促进Aβ_(40)二次成核并形成富含β-折叠结构的纤维状聚集体.其中,纤维状种子比球形种子的促进作用更强并具有浓度依赖效应.值得注意的是,两种形貌的种子诱导的Aβ_(40)聚集体细胞毒性具有明显差异.对比发现:球形种子诱导的Aβ_(40)聚集体比纤维状种子诱导的聚集体毒性显著加剧.本文明确了Cu~(2+)诱导产生的种子对Aβ聚集的促进作用,可为开发有效的Aβ聚集抑制剂提供理论依据.     

淫羊藿苷对更年期综合征模型大鼠的实验

目的:探讨淫羊藿苷对更年期综合征(CS)的影响.方法:将40只雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、淫羊藿苷低剂量治疗组(质量分数为25 mg/kg)、中剂量治疗组(质量分数为50 mg/kg)和高剂量组(质量分数为100 mg/kg)5组,每组8只.除假手术组外,其余各组大鼠去势4周,复制CS动物模型后,分别给予灌胃相应的生理盐水和药物60 d,采用放射免疫分析法检测各组大鼠血清雌二醇(E_2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)以及下丘脑β-内啡肽(β-EP)的含量,放射配体结合分析法检测子宫、脾脏雌激素受体(ER)水平.结果:与假手术组相比,模型组大鼠E_2、下丘脑β-EP以及子宫、脾脏ER表达量显著性下降(P0.05),血清FSH与LH表达量显著性升高(P0.05).与模型组相比,淫羊藿苷低、中、高剂量治疗组模型组大鼠E_2、下丘脑β-EP以及子宫、脾脏ER表达量显著性上升(P0.05),血清FSH与LH表达量显著性降低(P0.05),且淫羊藿苷剂量越高,治疗效果越高.结论:淫羊藿苷对更年期综合征有治疗作用.     

鸡胸腺素β_4串联体的原核表达、纯化与活性

构建鸡Tβ4基因串联体(2Tβ4)原核表达体系,利用Ni-NTA纯化重组2Tβ4,MTT法检测其免疫活性.结果表明,构建的PET-32a(+)-2Tβ4表达载体在BL21(DE3)感受态细胞中,经0.05 mmol/LIPTG诱导表达,每克菌体平均可获6.7mg 2Tβ4.2Tβ4对淋巴细胞增殖能力与Tβ4标准品相比无显著差异,证明了所构建的鸡2Tβ4原核表达系统的有效性,为Tβ4的应用提供了基础材料.     

MEK5α和MEK5β调控Beclin 1启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.     

温郁金挥发油对Aβ_(25-35)致阿尔兹海默病小鼠模型行为学的影响

目的研究温郁金挥发油对β-淀粉样蛋白(Aβ_(25-35))致阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的学习记忆改善作用。方法 60只昆明种小鼠随机分为假手术组,模型组,温郁金挥发油低(0.016 mL/kg)、高(0.048 mL/kg)剂量组,盐酸多奈哌齐组(1.30 mg/kg)及参枝苓组(2.6 mL/kg),海马内注射(Aβ_(25-35)),制作小鼠AD模型。连续灌胃给药15 d。Y迷宫和Morris水迷宫实验检测各组小鼠认知行为的改变,HE染色观察其对AD模型小鼠神经元的影响。结果温郁金挥发油可显著增加AD模型小鼠的自发交替反应率,缩短逃避潜伏期,减少总路程,延长游泳路程百分比,具有统计学意义(P0.05或P0.01);可改善海马区神经元细胞排列紊乱、水肿等现象,减少神经元死亡。结论温郁金挥发油对Aβ_(25-35)致阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力具有改善作用。     

星形胶质细胞调控下红花黄色素对Aβ_(1-42)介导的海马神经元突触损伤的保护作用研究

目的探讨星形胶质细胞存在下红花黄色素对Aβ_(1-42)诱导的神经元突触损伤的保护作用。方法采用Aβ_(1-42)损伤海马神经元模拟体外AD,不同浓度(0.01、0.1、1 g/L)红花黄色素进行干预,MTT法测定细胞存活率选择最佳浓度。建立纯化海马神经元培养体系(NE-S)和星形胶质细胞和神经元共混合培养体系(MIX-S),两种培养体系分别设立正常对照组、Aβ_(1-42)(15μmol/L)模型组、红花黄色素给药组。倒置显微镜下观察细胞形态;Western Blot检测神经元内SAP102蛋白表达水平。结果 (1)红花黄色素(0.01、0.1、1 g/L)能够显著提高神经元的存活率,且具有剂量依赖性;(2)神经元形态结果显示在MIX-S的模型组中神经元突触萎缩状态较NE-S的模型组稍微有所改善。红花黄色素(1 g/L)能明显改善NE-S和MIX-S中的神经元突触萎缩状态,但NE-S和MIX-S中的红花黄色素1 g/L给药组神经元形态没有差异性;(3) Western Blot结果显示在MIX-S的模型组中SAP102蛋白表达较NE-S的模型组有所增加。在NE-S和MIX-S中的红花黄色素1 g/L给药组SAP102蛋白表达都明显上调,但NE-S和MIX-S中的红花黄色素1 g/L给药组SAP102蛋白含量没有差异性。结论星形胶质细胞的存在可增加Aβ_(1-42)损伤的神经元突触蛋白的表达,但并不提高SY对神经元突触损伤的保护作用。     

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16~(INK4a)启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967~-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.     

某些赋β_1—范空间B(E—E_1)中可达范数算子的稠密性问题

在B(E→E_1)中可达范数算子的稠密性问题的讨论中,当E、E_1皆为赋范线性空间时,已有许多结果。但是当E,E_1或其中至少有一为赋β—范空间时,B(E→E_1)中可达范数算子是否稠于全空间,这个问题的结果还所见不多。本文对此做了初步探讨,得到了B(l~p→l~p1),B(l~p→l~∞)、B(l~p→C[0,1])(0相似文献   

1,25-(OH)_2D_3对阿霉素肾病大鼠足细胞的保护作用

目的研究维生素D3[1,25-(OH)_2D_3]对阿霉素(adriamyicin,ADR)肾病大鼠足细胞损伤的影响。方法将60只ADR诱导的雄性SD大鼠随机分为阿霉素模型组(ADR)和维生素D3治疗组(ADR+1,25-(OH2)D3),另取30只大鼠作为空白对照组(control)。给予活性维生素D3进行干预,实验期间,每天观察和记录大鼠的行为和外观,并每周记录体重。于注射ADR后第2、4、6、8、10周采集大鼠24 h尿样,检测大鼠24 h尿蛋白定量(urine total protein,UTP)。腹主动脉采血,测定血清总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,Alb)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、肌酐(creatinine,Cre)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),取肾并称肾重。透射电镜观察肾脏足细胞和基底膜的变化,肾组织nephrin蛋白表达的检测通过免疫组化技术实现。结果生化结果显示,同时期内,模型组大鼠UTP、Cre、BUN、TC水平比对照组明显升高(P0.05),TP、Alb显著降低(P0.05);与模型组相比,治疗组大鼠各项指标有明显的改善趋势(P0.05)。透射电镜结果显示,模型组大鼠肾小球内上皮细胞足突融合、脱落严重,胞体内出现异常颗粒;治疗组足细胞损伤有所修复。免疫组化结果显示,nephrin蛋白于肾小球足细胞胞膜处表达,对照组大鼠可见强阳性表达,模型组大鼠表达明显降低,活性维生素D3治疗后有所逆转。结论 1,25-(OH)_2D_3对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤有修复作用:能够上调nephrin蛋白的表达,减少蛋白尿以及足细胞足突融合脱落,从而起到保护肾脏的作用。     

原子核的单粒位阱(Ⅲ)——非厄米位阱u_(αβ)=M_(αβ)(ε_β)的本征值

本文证明了以下结果:虽然单粒位阱u_(αβ)=M_(αβ)(εβ)[或u_(αβ)=M_(αβ)(εα),M_(αβ)(ω)为质量算符]是非厄米的,但由它所确定的断续本征值ω_γ,却一定是实的,而且严格满足以下关系: ω_γ=±[E_n_γ(N±1)-E_0(N)]其中E_0(N)与E_n_γ(N±1)分别表示满壳核(核子数为N)基态与(N±1)核的严格能量本征值。 此外,为了判断任一单粒位阱的本征值是否也可能满足上述关系,文中给出了一个计算其判据的简便方法,应用这一方法很容易地算出单粒格林函数的振幅修正。     

连翘酯苷A对Aβ_(25-35)聚集体引起的神经损伤的改善作用研究

阿尔茨海默病(AD)的发病与脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积有关。在Aβ25-35聚集体诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22细胞炎症模型上,探究了连翘酯苷A对神经炎症损伤的改善作用。用MTT法检测了HT22细胞的存活率;用Griess Reagent法检测了HT22细胞NO的分泌量;通过荧光光谱法和透射电镜法,确定了Aβ25-35的聚集状态。1~40μmol·L-1 Aβ25-35聚集体组比单体组的细胞存活率更低、NO的释放量更多,对HT22细胞的损伤更大。此外,与Aβ25-35聚集体模型组相比,连翘酯苷A组细胞存活率得到显著提高,NO的释放量显著减少,表明连翘酯苷A对Aβ25-35聚集体引起的神经炎症损伤有明显的改善作用。     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

纳米β-FeOOH对水中Cr(Ⅵ)吸附性能的研究

羟基氧化铁由于其较高的表面电荷和较大的比表面积,对重金属离子具有良好的吸附性能,本文采用三种不同的制备方法制得羟基氧化铁(FeOOH),对制得的样品进行了X-射线衍射(XRD)和透射电子显微镜(TEM)表征,并分别用比表面积分析仪和电泳仪测得产品的比表面积和zeta电位。XRD图谱分析结果表明三种产品均为β-FeOOH,而TEM分析结果表明,三种方法得到的β-FeOOH均为纳米级,其形貌分别为长六方形、梭形和纺锤形。所得三种β-FeOOH分别用于吸附模拟水样中Cr(Ⅵ),研究结果表明,三种方法制得的β-FeOOH以加入有机大分子壳聚糖制得的产品(S3)的吸附效果最好。由S3吸附Cr(Ⅵ)的吸附等温实验得出,在293 K、303 K和313 K时,其对Cr(Ⅵ)的饱和吸附量分别为15.45 mg/g,16.87 mg/g和18.48 mg/g。KF值随温度升高而不断增大,表明S3对Cr(VI)的吸附过程为吸热反应。     

多羟基甾醇的合成(Ⅳ):20-亚甲基-4-孕烯-3β,6β-二醇的制备及其抗肿瘤活性研究

从孕烯醇酮(4)出发,经过6步反应合成新的多羟基甾醇化合物20-亚甲基-4-孕烯-β,6β-二醇(3),总收率为33.40％,并通过IR、^1H NMR 等谱图数据对化合物(3)的结构进行表征。用0．005 mg／ml化合物(3)和0．05 mg／ml的4-孕烯-3β,6β-二羟基-20-酮(9),通过MTT法对宫颈癌细胞(HELA)及白血病细胞(P-388)进行抗肿瘤细胞活性研究,结果表明,化合物(3)对HELA和P-388的生长均没有产生明显的细胞毒性。     

基于雌激素受体的全人源基因表达调控系统的构建与优化

目前基因治疗已经成为精准医疗体系中重要组成部分。然而,靶标基因在体内表达量的不可控给基因治疗的安全性带来一定风险。本研究在雌激素受体诱导系统的基础上,优化构建了全人源基因调控系统,并通过绿色荧光(Green fluorescent protein,GFP)或荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)跟踪诱导系统的活性。当使用外源诱导药物4-羟基他莫昔芬和内源诱导药物17β-雌二醇进行诱导时,前者可以高效诱导GFP和Gluc在HEK293细胞中的表达,并且表达强度与剂量呈正相关。通过水高压将载体注入小鼠体内,进行药物诱导后发现,4-羟基他莫昔芬更高效的诱导报告基因GFP的表达。成年小鼠尾静脉注射1×10~(13)vg/kg的AAV2/8-pZFHD1-hER-GFP病毒实验结果显示,第一次给药后,能够明显观察到GFP在肝脏组织的表达,但是药物在小鼠体内被代谢后,GFP的表达消失;当再次给药后,GFP荧光又重新被诱导。综上所述,本研究构建的人源化雌激素受体介导的调控系统在体内外均可调控目的基因的表达及开关。     

双功能抑制剂SK10对Cu~(2+)存在下Aβ聚集的抑制和解聚作用

由于β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的聚集是阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)发病机制中的关键过程,而金属离子Cu~(2+)存在下的Aβ的聚集速率加快,且Cu~(2+)本身会促进活性氧(ROS)的产生,增加神经毒性,因此开发既能螯合Cu~(2+)又能抑制Aβ聚集的双功能抑制剂非常重要.本文将金属螯合三肽(SSH)和Aβ聚集七肽抑制剂相组合,设计合成了新的双功能Aβ聚集十肽抑制剂SSHLVFFARK-通过硫代黄素T(ThT)荧光实验、聚集动力学实验、原子力显微镜检测(AFM)、等温滴定量热和MTT细胞毒性测定等研究了SK10对Cu~(2+)存在下Aβ聚集的抑制和解聚作用以及细胞毒性的抑制作用.实验结果表明:SK10不仅可以抑制Cu~(2+)存在下的Aβ40聚集(ThT荧光强度降低了60%),随着SK10浓度的提高使Aβ40纤维逐渐减少,还能降低Cu~(2+)存在下Aβ40聚集产生的细胞毒性,使细胞活性恢复至90%以上;同样,SK10对Cu~(2+)存在下的Aβ42聚集也有抑制作用.由于SK10对Cu~(2+)具有较强的特异性亲和力,能够螯合复合物中的Cu~(2+),因此能抑制由Cu~(2+)催化产生的活性氧(ROS)对细胞的毒性.进一步研究表明SK10还可解聚形成的聚集体,使已形成的聚集体消失,缓解其产生的细胞毒性,使细胞活性提高到90%.以上研究结果不但体现了SK10的药用潜力,也为今后设计和开发金属螯合Aβ聚集双功能抑制剂提供了思路.     

耐热β-半乳糖苷酶(Pyrococcus furiosus DSM 3638)活性位点N415S点突变对其酶活性的影响

β-半乳糖苷酶具有将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的能力,也具有把半乳糖聚合成低聚半乳糖的能力。这两种能力在工业生产中具有不同的意义。通过点突变使β-galactosidase[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突变为丝氨酸(Ser or S),突变体构建于毕赤酵母表达质粒载体,并筛选以毕赤酵母为宿主细胞的工程菌种,以此制备β-半乳糖苷酶的突变体酶蛋白。研究发现,该突变体的β-半乳糖苷酶活性在95℃、p H5.5时达到最高酶活,为耐高温乳糖酶,且该突变体水解牛奶的能力较好,可用于低乳糖牛奶及其相关制品加工中。而突变后β-半乳糖苷酶的另一个活性,即产生低聚半乳糖的能力的活性也有所提高,但不够明显。因此该位点突变可用于乳制品的加工,但不能期盼产生更多的半乳糖寡聚体。