柽柳 GF14基因的克隆与表达分析

生物体中普遍存在的14-3-3蛋白(也称GF14蛋白)能够参与植物的一系列应激响应过程。笔者以柽柳(Tamarix hispida)为材料,从6个柽柳cDNA文库中分离出5条GF14 基因,依次命名为ThGF14a—ThGF14e。对5条GF14 基因进行生物信息学研究,并利用qRT-PCR技术对胁迫处理后的基因表达模式进行分析。结果显示:ThGF14 蛋白除了N和C末端的氨基酸外均含有一个高度保守的14-3-3 结构域,这些ThGF14蛋白分属于ε-like 和 non-ε 两种类型; 大多数 ThGF14基因在NaCl、PEG、4 ℃、CdCl₂处理不同时间(6,24,48 和 72 h)的叶和根中能够被诱导表达(表达量>2倍),且不同基因间对非生物胁迫应答表现出差异,其中ThGF14c 基因在叶和根中不同胁迫条件下的表达水平均最高。研究表明,柽柳 ThGF14 基因能够参与植物的非生物胁迫应答响应过程。     

柽柳ThPR1基因的克隆与表达分析

通过对盐胁迫后刚毛柽柳(Tamarix hispida)7个转录组分析,鉴定获得病程蛋白相关基因PR1(命名为ThPR1)全长cDNA序列,该基因全长756 bp,编码区长537 bp,编码含178个氨基酸的蛋白质,分子质量为20.53 ku,理论等电点(pI)为9.75。为了研究该基因对逆境胁迫的应答情况,采用实时定量RT-PCR技术分析了刚毛柽柳在PEG、NaCl胁迫及外源ABA处理后不同组织中基因的表达。结果表明,NaCl会诱导ThPR1基因在根和叶中的表达,而PEG和ABA处理则抑制该基因在根和叶中的表达。     

柽柳GF14基因的克隆与表达分析（英文）

生物体中普遍存在的14-3-3蛋白(也称GF14蛋白)能够参与植物的一系列应激响应过程。笔者以柽柳(Tamarix hispida)为材料,从6个柽柳cDNA文库中分离出5条GF14基因,依次命名为ThGF14a—ThGF14e。对5条GF14基因进行生物信息学研究,并利用qRT-PCR技术对胁迫处理后的基因表达模式进行分析。结果显示:ThGF14蛋白除了N和C末端的氨基酸外均含有一个高度保守的14-3-3结构域,这些ThGF14蛋白分属于ε-like和non-ε两种类型;大多数ThGF14基因在NaCl、PEG、4℃、CdCl_2处理不同时间(6,24,48和72 h)的叶和根中能够被诱导表达(表达量2倍),且不同基因间对非生物胁迫应答表现出差异,其中ThGF14c基因在叶和根中不同胁迫条件下的表达水平均最高。研究表明,柽柳ThGF14基因能够参与植物的非生物胁迫应答响应过程。     

棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白Gh GAI2b基因,构建p BP35S:Gh GAI2b和p BP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白Gh GAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白Gh GAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。     

长爪沙鼠Eef1a2基因的克隆与同源性分析

目的长爪沙鼠真核蛋白延长因子1a2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,Eef1a2)基因的克隆,测序和同源性分析。方法提取长爪沙鼠骨骼肌组织的mRNA,通过同源扩增和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆Eef1a2 cDNA序列全长。通过DANSTAR软件比对长爪沙鼠和人类、大鼠、小鼠Eef1a2的cDNA和氨基酸序列,并分析其同源性。结果长爪沙鼠Eef1a2 cDNA序列全长1812 bp,编码区(coding sequence,CDs)1392 bp,编码463个氨基酸。其核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为88.6%,94.0%和93.8%;长爪沙鼠Eef1a2氨基酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为100%,99.9%和99.9%。结论长爪沙鼠Eef1a2的核苷酸序列和氨基酸序列均与人、大鼠、小鼠高度同源。因此,长爪沙鼠可能是一种人类Eef1a2基因研究的理想模型。     

大黄鱼cyp19a/b基因的克隆与表达分析

克隆得到了调节雌雄激素平衡的大黄鱼cyp19a/b基因,cyp19a基因c DNA全长1805 bp(NCBI登录号:FJ800566),其中开放阅读框1557 bp,编码518个氨基酸;cyp19b基因c DNA全长2268 bp(NCBI登录号:FJ800567),其中开放阅读框1503 bp,编码500个氨基酸.荧光定量PCR分析显示cyp19a基因在性腺中有明显的表达,且在卵巢中的表达量极显著且高于精巢;在肌肉、脑、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官中基本不表达.而cyp19b基因在脑、脾脏和肝脏中有较高表达,在性腺和其他器官中基本不表达.     

羚牛细胞色素b基因序列分析和系统进化研究

应用聚合酶链式反应（PCR）分别扩增了羚牛、绵羊、山羊、黄牛细胞色素b基因,并对其全序列（1140bp）进行了测定。其中羚牛细胞色素b基因序列属首次报道。通过对8种偶蹄类动物细胞色素b基因序列差异分析和基于序列差异所构建的分子系统树,发现羚牛与羊亚科的动物亲缘关系最近,与其他动物亲缘关系较远。表明将羚牛放入羊亚科较为合理,序列差异分析还表明羚羊约在距今500万年前（上新世）从牛类动物中分化出来,牛类分化时间约在600万年前的中新世（Miocene）。     

文昌鱼Rbx1同源基因的克隆，进化分析和表达图式的研究

在青岛文昌鱼中首次克隆到一个RING box同源基因，对其进行了序列特征和系统进化学分析，并且研究了该基因的胚胎发育和成体表达图式。AmphiRbx1演绎的蛋白序列与已知其他无脊椎动物和脊椎动物的同源分子表现出很高的相似性。利用原位杂交和RT-PCR技术研究该基因的表达，结果显示AmphiRbx1在胚胎发育各期均有表达，特别是在卵裂期胚胎和有高速分裂细胞的组织中有很强的表达。实验结果表明，Rbx1基因在进化中相当保守，AmphiRbx1可能在细胞分裂的调节中发挥作用。     

猪Klf4、Klf5和Egr2基因内含子的克隆及进化分析

从猪肝脏提取基因组作为模板,分别扩增了Klf4、Klf5和Egr2的第3、第2和第1内含子,长度分别为916、1027和1342bp,并通过其两端连接的部分外显子序列与Genbank序列比对加以确认,并和人相应基因内含子作长度和序列同源性比较。结果表明,由内含子比对得出的这些基因在人和猪间的保守程度与这些基因在氨基酸水平上比对得出的保守程度相一致。     

不同倍性鲤科鱼CyclinB基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼CyclinB基因部分DNA序列．结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼CyclinB基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类CyclinB基因DNA片段序列进行比较分析．结果表明：由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750bp,950bp,720bp和720bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段（1200bp和900bp）,三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段（1200bp,900bp和750bp）,每个DNA片段均含CyclinB基因第2,3内含子和第2,3,4外显子．序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200bp片段同源性分别为99．5％,98．9％,99．5％和88．7％,与母本900bp片段同源性分别为97．5％,94．6％,94．2％和89．99／6,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200bp和900bpCyclinB基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性．而三倍体和五倍体鲫鲂的750bpCyclinB基因片段-9父本同源性分别高达98．6％和98．2％,说明其来自父本团头鲂．在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本CyclinB基因片段序列消除现象．此外,用CyclinB基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由CyclinB基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析．     

海南产花鳗鲡细胞色素b基因的克隆及序列分析

线粒体细胞色素b基因是目前研究鱼类分子系统进化的重要分子标记.笔者以日本鳗鲡线粒体基因组序列为模板设计并合成引物进行PCR扩增,并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和纯化后,克隆到pMD18-T载体、测序,成功得到全长为1 140 bp的海南产花鳗鲡细胞色素b(Cyt b)基因序列.将该基因全长序列递交到Genebank数据库,获得序列登录号为EF690363.用DNA分析软件MEGA2比较了海南产花鳗鲡与递交到GenBank中的8种分布在中国东南沿海、日本海域及南太平洋海域的鳗鲡属(Anguillia)细胞色素b基因的地理差异,并构建了系统进化树.结果显示:日本产和夏威夷产花鳗的地理差异小于海南产花鳗与它们之间的地理差异.     

胡萝卜DcPS基因的克隆、进化及根发育中表达分析

补骨素合成酶(PS)是胡萝卜营养物质补骨素生物合成的关键酶.从'黑田五寸'胡萝卜中克隆得到DcPS基因,对其进行了进化和在胡萝卜根发育过程中表达水平分析.结果表明,DcPS基因长1518 bp,编码氨基酸505 aa,属于细胞色素P450超级基因家族.其氨基酸序列含有10个明显的特征,其中含有1个跨膜区,为亲水性蛋白....     

大黄鱼Ghrelin基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE等技术,从大黄鱼胃组织中克隆得出Ghrelin基因的cDNA(649 bp),其中包含5'非翻译区(5'UTR),起始密码子,信号肽、成熟肽、C-端肽序列的编码区,终止密码子,3'非翻译区(3'UTR)和相对较少见的多核苷酸化信号(ATTAAA).获得的cDNA编码108个氨基酸,与已报道的硬骨鱼类Grelin mRNA比对显示,相似性(Similarity)和一致性(Identity)最高(黑鲷 Acanthopagrus schlegelii)可达81%和73%,推测的成熟肽包含硬骨鱼Ghrelin的相同活性中心和修饰位点,证明是鱼类Ghrelin同源基因.     

SpltNPVp49基因的克隆和序列分析

根据新发现的杆状病毒凋亡抑制基因ｐ４９基因的序列设计了一对引物,以ＳｐｌｔＮＰＶ基因组ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增获得了预期大小的约１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段,将此片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上并直接测序。序列分析表明,该片段为ＳｐｌｔＮＰＶ完整的ｐ４９基因开放读码框。与已知的杆状病毒ｐ４９基因的序列同源性为８７％,与之对应的氨基酸序列的同源性高达９３％。它是首次从ＳｐｌｔＮＰＶ中克隆到的抑制细胞凋亡的     

无蹼壁虎EMC3基因cDNA全长克隆与进化分析

为了探究无蹼壁虎(Gekko swinhonis)EMC3基因(命名为GsEMC3)的序列特征,了解GsEMC3蛋白的结构和功能,探讨GsEMC3蛋白与其他物种EMC3蛋白的进化关系,采用SMART RACE技术克隆获得了GsEMC3的全长cDNA序列,通过信息学分析阐明了GsEMC3基因的序列特征以及GsEMC3蛋白的结构和功能,系统发育和选择压力分析研究了GsEMC3的进化特征. GsEMC3基因的cDNA全长为1 023 bp,包含1个786 bp的开放阅读框,基因编码1个含261个氨基酸的多肽. GsEMC3蛋白的相对分子质量约为30.074×10³,理论等电点为5.57.生物信息学分析表明,无蹼壁虎GsEMC3为疏水性非分泌型蛋白,有2个跨膜区,可能是一个动态定位的蛋白,无信号肽,直接在细胞内发挥作用.其分子量与已知的其他物种的EMC3蛋白相近. GsEMC3蛋白含有1个DUF106结构域,二级结构包含12个α-螺旋、1个β-折叠、13个无规则卷曲.系统发育分析表明,无蹼壁虎GsEMC3蛋白序列与美国短吻鳄(Alligator mississippien...     

不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

鸟类TLR基因进化分析

为了明确鸟类Toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)基因物种间拷贝数量差异和基因进化选择,本试验利用BLAST程序对73种鸟类基因组数据进行TLR基因的鉴定,将预测到的序列进行系统发育分析,分析其进化选择方向,探究鸟类TLR基因进化机制.结果显示：1)在73种鸟类中可以预测发现大多数的TLR基因,TLR7基因存在多拷贝现象,多数发生在雀形目中,TLR21在部分鸟类中未预测到;2)在大多鸟类物种中,TLR3基因和TLR21基因表现出正向选择;3)在不同类群中部分TLR基因进化存在差异.结果表明鸟类TLR基因存在不同的选择进化方向.     

三种蝙蝠线粒体解偶联蛋白2（UCP2）基因的克隆和进化分析

根据几种哺乳动物UCP2基因的保守区设计一对简并引物,扩增马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）、长翼蝠（Miniopterus fuliginosus）和犬蝠（Cynopterus sphinx）的UCP2基因的全部编码区序列.测序结果表明,三种蝙蝠UCP2编码区全长930 bp,编码309个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白的3个特征结构及解偶联蛋白（UCPs）的特征序列.序列分析表明,蝙蝠与其它哺乳动物UCP2的氨基酸推导序列有很高的同源性,为90.6%~97.0%.进化分析表明,UCP2基因在哺乳动物中进化过程中非常保守,受到强烈的纯化选择压力作用（ω=0.063）.Branch-specific 模型分析表明,UCP2基因在蝙蝠支系与其它不能飞行的哺乳动物、冬眠蝙蝠与非冬眠蝙蝠的进化过程所受到的选择压力无明显差异（P>0.05）.这说明在整个哺乳动物进化过程中UCP2对其能量代谢的调控均起到了重要作用.然而,UCP2如何参与哺乳动物能量调控仍有待于进一步研究.     

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

 从南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A (29.0%),351 C (20.7%),362 G (21.4%)和489 T (28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值) 模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支－位点模型的分析表明：紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。     

郑麦366γ-醇溶蛋白基因的克隆、系统进化和乳糜泻毒性分析

采用基因组PCR法,从强筋优质小麦品种郑麦366中克隆得到12个具有独特编码区的γ-醇溶蛋白新基因(命名为ZH366R-1-ZH366R-12,GenBank注册序列号为JN849083-JN849089和JX828391-JX828395),其中,ZH366R-5、ZH366R-8、ZH366R-11和ZH366R-12有完整的开放阅读框,除ZH366R-8存在一个额外的半胱氨酸(C)外,其他3个基因均具有γ-醇溶蛋白的典型分子特征,含有8个保守的半胱氨酸残基.克隆基因与42个来源于强筋优质小麦品种或代表普通小麦起源的二倍体祖先供体种的γ-醇溶蛋白的聚类分析和已知免疫多肽的分布分析表明,γ-醇溶蛋白在整个推断氨基酸序列和主要免疫肽的分布上均存在一定的基因组特异性.在重复区II含有1个额外半胱氨酸残基的γ-醇溶蛋白通常是由Gli-B1位点编码的,且在优质强筋小麦品种中均有分布,推测Gli-B1位点编码的γ-醇溶蛋白可能对面筋品质有独特贡献,而由Gli-D1位点编码的γ-醇溶蛋白,通常在重复区II分布有较多种类和数量的免疫多肽,乳糜泻(CD)毒性最强.