牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

猫细小病毒 PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的 建立猫细小病毒 PCR 检测方法,应用于猫临床样本中 FPV 的快速检测。方法 根据已发表的 FPV VP2 基因序列设计合成引物,并以此建立 FPV 的 PCR 检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。 用建立的方法对 33 份猫临床样品进行检测。结果 建立的 FPV PCR 检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠 状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为 5lgTCID50 / mL,相应的 DNA 模板浓度为 4. 9 × 102 拷贝/μL;FPV DNA 在 － 30℃冰箱放置 12 个月仍可检测出目的条带。应用 该方法从 33 份猫临床样本中检测出 21 份 FPV 核酸阳性。结论 建立的 FPV PCR 检测方法具有特异、敏感及稳定 的特点,适合于临床 FPV 的感染检测。     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

河北省滦县牛梨形虫的分子检测

本研究旨在检测河北省滦县牛梨形虫的感染情况。采集滦县牛血液样本28份,并提取基因组DNA;根据已发表的梨形虫Tams1,P32表面蛋白以及18S rRNA基因序列,设计6对梨形虫特异性引物,以牛血液基因组DNA为模板,对不同梨形虫进行PCR或巢式PCR扩增。结果表明,在28份DNA样本中检测出双芽巴贝斯虫阳性样本7份,阳性率为25.00%;其他牛巴贝斯虫阳性样本3份,阳性率10.71%;而环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫均未检测到阳性样本。     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

牛疱疹病毒1型检测技术及疫苗研究进展

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛疱疹病毒I型(Bovine herpes virus-1,BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病.该病毒的危害性在于病毒侵入牛机体后,潜伏在一些特定的部位,致使病毒持续性感染,病牛长期甚至终身带毒,给控制和消灭本病带来很大困难,给全球养牛业造成了重大经济损失.文章就BHV-1分子生物学、诊断及各类疫苗进行阐述,旨在为该病的进一步研究提供理论参考.     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立鸽圆环病毒(PiCV)TaqMan探针荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 通过比对NCBI发表的PiCV各分离株序列,选取其polymerase基因保守序列设计引物探针,建立PiCV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性及敏感性进行验证;取浓度为3.48×10⁵和3.48×10⁴copies/μL的质粒标准品,每个浓度做6个平行,重复检测3次,计算组内和组间变异系数,验证方法的重复性和稳定性;用该方法检测采自北京某养殖场的鸽肝、脾、肺、法式囊样本各40份及鸽盲肠样本36份,以验证此方法在实际应用中的检测能力。结果 建立的PiCV荧光定量PCR方法在3.48×10⁷～3.48×10¹ copies/μL范围Ct值与质粒浓度呈线性关系,标准曲线Slope为-3.381,R²值为1,扩增效率为97.61%。可检测到的PiCV最低浓度为34.8 copies/μL,与常规PCR法相比,检测灵敏度高2个数量级;以猪圆环病毒2型、禽腺病毒I型及III型、禽白血病病毒、禽网状...     

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse line probe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3'、5'对称加有poly-C的特异性探针和5'标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1 ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5％以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100％,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09％(103/105)、100％ (43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.     

人博卡病毒微滴数字PCR定量方法的建立

为准确、快速地从临床鼻咽拭子样本中筛选出人博卡病毒(HBoV)感染的阳性样本,以HBoV-sh9基因的保守区序列为检测靶标合成引物和探针,建立了微滴数字PCR(dd PCR)检测HBoV的方法.结果表明:HBoV dd PCR方法具有较高的特异性,在(0.5~6.8)×10~3copies/μL HBoV DNA浓度范围内,具有良好的线性和精确度,定量限低至0.5 copies/μL.182份临床样本检测结果显示:HBoV感染的阳性率为8.24%.此建立的HBoV dd PCR方法在定量限、准确性和重复性上较常规PCR优势明显,不受样品基质和扩增效率的影响.     

猴腺病毒Ⅰ型间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用*

摘要: 目的建立检测血清中猴腺病毒Ⅰ型( SAdV-1) 抗体的间接免疫荧光方法( IFA) ,为检测实验猴群中SAdV-1 的感染情况提供参考依据。方法用SAdV-1 病毒感染BSC-1 细胞,待50% 细胞出现病变时,用胰蛋白酶消化以 20μL 1 × 107 个/mL 浓度的细胞液滴到24 孔镀膜玻片上,丙酮固定。利用制备的抗原片通过浓度滴定确定猴血清、 羊抗猴二抗最佳工作条件。对IFA 进行特异性、敏感性、重复性验证并初步检测猴血清样本。结果建立了SAdV- 1 抗体的间接免疫荧光检测方法。在采集的21 份猴血清样本中,检出SAdV-1 抗体阳性9 例,12 例血清检测为阴 性。结论方法具有良好的特异性和稳定性,可作为SAdV-1 检测的可靠方法。     

四川部分地区肉牛鼻腔中支原体的PCR检测及分析

为了解四川部分地区肉牛呼吸道病例中支原体的带菌情况及种类,从四川部分地区6个牛场的54头有呼吸道症状的肉牛鼻腔采取的棉拭子,经支原体属特异性PCR方法检测,并对特异性PCR产物克隆测序后比对分析鉴定支原体的种类;用牛支原体、牛眼支原体、殊异支原体和牛鼻支原体的特异性检测引物对这54份样本进行了检测,调查支原体感染情况.结果从54份肉牛鼻腔棉拭子样本中检出23份支原体阳性样本;鉴牛支原体(12/54)、牛眼支原体(6/54)、殊异支原体(3/54)和牛鼻支原体(2/54)共4种支原体.4种支原体特异性检测结果显示,牛支原体的感染率为57.3%,殊异支原体的感染率为29.63%,牛眼支原体检出率为20.37%,牛鼻支原体的检出率为16.67%.在两种支原体混合感染中,检出率相对较高的是以牛支原体+殊异支原体模式的混合感染,检出率为16.67%;三种支原体混合感染的情况有出现,而四种支原体混合感染的情况没有被检出.结果表明,四川省肉牛呼吸道疾病样本中支原体感染较为普遍,且种类较多,其中牛支原体检出率最高,首次在国内牛中检出牛眼支原体,研究结果丰富了国内牛呼吸道疾病的病原谱.     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

多重PCR检测病死鸡中沙门氏菌方法的研究

为了建立能够同时检测病死鸡样品中的沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的多重PCR 方法.采用煮沸法提取 DNA 做为模板,选择分别针对沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异性基因(invA、fliC、sdfⅠ)设计引物,优化反应体系和反应参数,建立多重PCR检测方法.应用该方法对国内17家鸡场369份病死鸡样品进行沙门氏菌的检测,检测结果与传统细菌培养法的结果进行比较.结果表明,优化过的多重 PCR 可同时对沙门氏菌种、属进行鉴定,灵敏度为4.6×102 CFU/mL;多重 PCR 方法共检测出沙门氏菌34株,其中鸡白痢沙门氏菌21株、肠炎沙门氏菌5株,与传统细菌培养法检测结果的符合率分别为91.2%、90.5%和80.0%.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法的建立与初步应用

摘要: 目的 建立猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法,应用于临床样品中 FHV-1 抗体的检测。方法 培养猫肾传代细胞( CRFK) ,接种 FHV-1 病毒,制备 CRFK 正常抗原和 FHV-1 特异抗原,滴定山羊抗猫 IgG-HRP 和 抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、稳定性及精密性实验。结果 正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工 作浓度分别为 0. 05 μg /mL、10 μg /mL 和 1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为 8. 7% 和 5. 8% ,批间平均变异系数分别为 11. 9% 和 6. 6% ; 检测灵敏度为 1∶ 6 400; 与猫细小病毒( FPV) 、猫杯状病毒( FCV) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于 25% 。结论 建立的 ELISA 方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强,可用于猫 FHV-1 抗体的检测。     

河北省新乐市羊梨形虫分子检测

为检测河北省新乐市羊梨形虫的感染情况,采集河北省新乐市羊血液样本31份,并提取基因组DNA;根据梨形虫18S rRNA基因序列设计5对特异性引物,以羊血液基因组DNA为模板,对梨形虫进行巢式PCR扩增。结果表明,在31份DNA样本中检测出4份吕氏泰勒虫(12.9%),而尤氏泰勒虫、中华泰勒虫和羊巴贝斯虫均未检测到阳性样本。     

猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

目的从临床疑似猫病毒性鼻气管炎的病例中分离猫疱疹病毒Ⅰ型。方法用猫肾细胞(FK-81)对临床疑似猫病毒性鼻气管炎病猫的眼鼻分泌物进行分离培养,连续传4代,对获得的培养物进行了电子显微镜观察、血凝试验、病毒核酸型试验、理化特性试验以及PCR扩增和扩增产物基因测序鉴定。结果该病毒粒子呈球形,直径为160 nm左右,有囊膜。凝集猫红细胞,不凝集猪、兔、犬、小鼠和鸡的红细胞。病毒对乙醚、酸、热、胰蛋白酶敏感,其核酸型属DNA。PCR扩增为猫疱疹病毒Ⅰ型阳性,扩增产物基因序列与Nunberg等报道猫疱疹病毒Ⅰ型的基因序列同源性为100%(登录号:M26660)。结论在国内首次成功分离一株猫疱疹病毒Ⅰ型,其形态、血凝性、理化特性、基因序列等与国外文献报道一致,为猫病毒性鼻气管炎病原学、疫苗免疫、诊断及分子生物学研究奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎病的研究进展

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)又名牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus-1,BHV-1)感染症,是一种急性、热性、接触性传染病,以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎、上呼吸道炎症和潜伏感染为主要特征。该病目前在世界范围内流行,除南美部分国家之外,世界各国都已分离到该病毒,在我国部分省市该病有蔓延趋势。文章主要针对该病的病原学、流行病学、诊断与防控进行了阐述,为认识和研究该病提供一定的理论参考。     

布鲁氏菌PCR鉴定方法的研究与应用

目的:分析采用PCR法对于布鲁氏菌的鉴定诊断价值以及实用价值,同时研究如何快速实现定量荧光PCR检测,以及对组装PCR试剂盒的方法进行分析。方法:对布鲁氏菌进行常规鉴定,提取试验样本DNA,设计引物。结果:柯氏染色实验后,样本呈红色;在PCR分型方面,野毒株与疫苗株以及标准株共为15种,阴性没有表现出扩增片段。菌种包括了猪种、羊附睾种、羊种以及牛种,阴性没有表现出扩增片段;牛Ⅲ型以及羊Ⅱ型无特异性表现,牛Ⅰ型菌为野毒株。结论:PCR可以有效预防实验人员在操作的过程中被菌株感染,安全性良好,具有较高的应用价值。