阳离子脂质体基因载体的稳定性研究

从阳离子脂质体的形态、平均粒径、粒径分布、Zeta电位及浊度等方面,考察了季铵盐型阳离子脂质体CPA14的稳定性。经透射电子显微镜检测,阳离子脂质体呈球形结构,粒径为100~200 nm。经粒度分析仪检测,阳离子脂质体平均粒径为210~260 nm,颗粒分布均匀,Zeta电位为55~90 mV。脂质体在4 ℃条件下存放3个月,外观无明显变化,脂质体的浊度变化不大。证实季铵盐型阳离子脂质体CPA14稳定性良好,适合用作基因载体进行基因转运。阳离子脂质体与质粒DNA在N:P质量比为3:1时可高效转染人宫颈癌细胞,与商品转染试剂DOTAP转染效率相当。为新型季铵盐型阳离子脂质体基因载体的构建提供了理论依据。     

脂质体介导pcDNA3.1-HGF瞬时转染小鼠MSCs及转染效果检测

肝细胞生长因子(HGF)对各种组织都具有促分裂、促迁移、促细胞形态发生的作用,尤其是肾脏、肺和肠道.间充质干细胞(MSC)是一种具有多向分化潜能的干细胞,同时还具有相对的定位归巢以及免疫调节作用,由于MSC具有较低的免疫原性,可作为良好的基因载体.为联合应用HGF和MSC的作用,本实验在分离培养小鼠MSC并鉴定后;应用脂质体介导法将pcDNA3.1-HGF瞬时转染MSC;采用半定量RT-PCR和ELISA法分别鉴定HGF的表达情况.结果表明:转染试剂对MSC的活性无影响,转染细胞形态及定向分化特性未发生改变;HGF在转染后48 h达到最高表达量,随时间推移逐渐减低,在10 d时仍略高于对照.脂质体介导pcDNA3.1-HGF瞬时转染小鼠MSC后,HGF在转染后10 d内升高表达.     

阳离子脂质体在基因治疗中的应用

介绍了阳离子脂质体的组成和结构特点以及作为基因载体在基因治疗方面的应用．阳离子脂质体转基因的机理研究表明：阳离子脂质体／基因复合物进入细胞的方式依赖于细胞的内吞作用或通过细胞的膜融合作用．     

线性与分枝状聚乙烯亚胺介导基因体外转染的比较与研究

聚乙烯亚胺(PEI)是一类新兴的阳离子多聚物非病毒载体,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达.本文选用分子量750 ku分枝状PEI与分子量25 ku线性PEI转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因于HeLa细胞,并对这两种PEI的转染效率进行比较.利用MTT法检测比较线性PEI与分枝状PEI的细胞毒性.通过凝胶阻滞实验比较两种PEI结合DNA能力.最后利用肝素介导释放实验比较两者在形成PEI/DNA复合物后释放DNA的能力.研究结果表明:线性PEI转染效率优于分枝状PEI,且随PEI/DNA质量比的增加而升高,而分枝状PEI则相反;两种PEI细胞毒性在一定范围内相近;分枝状PEI结合DNA能力略强于线性PEI;但是分枝状PEI释放DNA的能力远小于线性PEI.这可能导致DNA在细胞内无法从PEI/DNA复合体上释放出来,从而影响转录的正常进行,最终导致分枝状PEI转染效率下降.     

《基因工程》实验教学改革的探索

《基因工程》实验课是生物类专业的重要实验课之一。文中根据近3年来在《基因工程》实验教学的实践中积累的经验和体会，对实验的内容、教学方法和手段进行了充实和改革，并取得了一定的成绩。     

脂质体--基因载体

概述了基因载体的作用、类型和脂质体用于基因载体的发展历史,介绍了一类很有前途的基因载体．阳离子脂质体的组成结构和分类及其转基因的作用原理,讨论了影响阳离子脂质体／DNA复合物物理化学性质的参数及其目标复合物的制备方法．     

新一代阳离子聚合物转染试剂(梭华-Sofast) 转染效果研究

采用DNA延滞实验研究新一代阳离子聚合物梭华 Sofast转染试剂与DNA的结合能力,以不同报告基因(绿色荧光蛋白基因、β 半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因),分析比较梭华 Sofast与阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳离子聚合物JetPEI、Superfect转染HEK293细胞转染效率和细胞毒性,研究梭华 Sofast转染试剂转染效率.实验结果表明梭华 Sofast与DNA有很强的结合能力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,梭华 Sofast转染率最高,约60%左右,而且在单个细胞中表达的GFP量多;转染细胞荧光素酶活性检测结果表明,当梭华 Sofast与DNA质量比为16时,转染率最高,高于109RLU/mg蛋白,分别是JetPEI,Superfect和Lipofectamine2000转染细胞最高活性的1.6,2.3和5倍;梭华 Sofast转染β 半乳糖苷酶的染色结果显示95%以上的阳性细胞转染率;比较基因转染效率最高时的细胞毒性,在最佳转染剂量时,几种试剂的细胞存活率均在83%以上,而梭华 Sofast为94.23%.在目前市场上销售的转染试剂对HUV EC细胞的转染效果均不理想情况下,梭华 Sofast仍具一定的转染效率,阳性细胞约占20%.研究结果表明梭华 Sofast是一种高转染效率,低细胞毒性的转染试剂.     

DPA-Zn金属阳离子脂质的合成及转染活性研究

基于Zn(II)-二甲基吡啶胺(Zn-DPA)合成了含十六烷基醇疏水性尾部的单/双核金属阳离子脂质6a-6b.通过凝胶电泳、溴乙锭置换和粒径电位实验考察了它们与质粒DNA的相互作用.结果表明,两个金属脂质均可将DNA包裹缩合成具有适当粒径大小和zeta电位的纳米颗粒.并且,双核金属脂质6b具有比单核脂质6a更强的DNA结合能力.MTT细胞毒性实验显示金属脂质体/DNA复合物具有较低细胞毒性(细胞存活率大于80%).体外基因转染研究表明,单核金属脂质6a的转染效率优于双核金属脂质6b.     

脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究

利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位。利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测。此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性。实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低。     

改革实验教学提高实验教学质量

本文在总结多年来实验教学管理经验的基础上，提出了改革实验教学，提高实验教学质量的有效途径，并且在实验教学管理的实践中得到了验证。     

供精个体和异种动物精浆对小鼠精子介导转染外源基因效率影响的研究

目的探讨供精个体和异种动物精浆对小鼠精子转染外源DNA效率的影响,以探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的影响因素。方法从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子,用DIG免疫组化方法检测和比较精予转染效率,因素为供精个体和异种动物精浆。结果不同供精个体间转染效率存在一定差异,但有的个体问差异极显著（P〈0．01）,而有的个体间差异不显著：共孵育体系中异种动物精浆可显著降低转染效率（实验组与对照组分别为（8．6±1．7）％VS（51．3±5.3）％,P〈0．01）。结论小鼠供精个体和异种动物精浆可影响小鼠精予转染外源DNA的效率。     

腺病毒介导BMP-4转染兔SMSCs软骨分化研究

目的 研究腺病毒介导BMP-4并带有绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染兔滑膜间充质干细胞(SMSCs)向软骨细胞分化的可行性。方法 兔膝关节腔取材,用Ⅰ型胶原酶消化分离获取SMSCs,采用流式细胞技术检测表面标记物。构建包含BMP-4基因和EGFP基因的腺病毒载体(Ad-BMP-4)并包装病毒。用不同感染复数(MOI分别为50、100、200、300、400、500)的病毒感染SMSCs,观察各组转染效率及检测不同MOI条件下细胞生长曲线,确定最合适的病毒感染滴度。进而应用ELISA检测分析染后的SMSCs是否进入软骨细胞分化谱系。结果 经分离纯化后获取的SMSCs形态学表现出间充质干细胞应有的结构,表面标记蛋白CD44、CD90高度表达,但CD34、CD45基本不表达,符合SMSCs的特征。分别以50、100、200、300、400、500MOI感染后,感染效率分别为54.3%、72.2%、77.8%、85%、86.6%、89.3%,而且感染效率依赖MOI高低,结合生长曲线300MOI为最佳感染滴度。ELISA法检测发现BMP-4显著高表达,同时软骨基因相关蛋白SOX9、COLⅡ及AGC蛋白也高表达。结论 应用300MOI重组腺病毒感染兔SMSCs细胞,能维持细胞正常增殖水平,且能快速高效地表达BMP-4并激活其他软骨相关基因,可促使SMSCs向软骨细胞分化。     

实验教学改革的探索

本文在论述实验教学改革必要性的基础上从开放实验教学。实验教学内容的安排与改进,实验教学的现代化、实验教学管理的改革等四个方面提出了一些看法和意见。     

大学物理实验教学改革

本文就当前高校在大学物理实验课开设中存在的一些问题做了深入地分析和研究,并结合教学实践从通过改革实验内容、强调学生主体主动性的发挥、拓展学生实验前沿科学知识水平等方面提出相关建议,以期对大学物理实验教学改革起到一定的借鉴作用。     

环境工程实验教学改革

根据环境工程实验课特点,尝试了实验教学改革,指出了实验教学改革中存在的问题,总结了实验教学改革的效果。     

电子电路实验教学改革

高等工科院校开设电子电路实验课,强化实践动手能力的培养,必须改革被动式的教学模式,实施自主式的教学模式,使学生由被动学习转变为主动学习,提高知识的综合应用、创新、独立分析和解决实际问题的能力。     

测量实验教学改革

基于测量实验课程的特点,结合高等教育培养学生实践能力和创新能力的要求以及工程测量的现状和发展趋势,根据多年的教学经验,提出了测量实验教学内容、教学方法、教学手段以及考核方法的改革内容,确保各教学环节的质量,对实验教学的组织实施具有一定的参考价值。     

电子技术实验教学改革

文章对电子技术实验教学在内容、方法和手段等方面提出几点看法,对培养学生的独立思考和实践能力提出了明确要求,以培养学生的实验技能和创新意识。     

实验教学改革初探

针对当前实验教学中存在的问题提出了深化实验教学改革的措施：加大投资力度，改善实验条件；改革实验内容和方法，注重学生能力培养；加强实验队伍建设，提高实验人员素质等加强实验教学改革的一些设想。