蚕豆大M染色体长臂端部的显微切割与PCR扩增

染色体微切与微克隆技术由于可以在分子水平上对特定染色体区域进行基因定位和结构研究,因此,当Scalenghe首次在果蝇唾腺染色体上取得成功后,很快将这种技术应用于小鼠、人的染色体上.并利用该技术对染色体特定区域从分子水平上进行详细研究,并得到很多有价值的结果.我国对人类染色体微切与微克隆也已有报道,如:夏家辉等成功地构建了人类7号染色体专特性探针池和14个染色体区带特异性探针池。 但植物染色体的显微切割体外扩增与微克隆技术由于染色体同步化和制片困难与动物相比进展缓慢,目前只有在甜菜中与抗线虫有关染色体及Schondelmaier在大麦IHS染色体、Albani在小麦染色体上作过报道.我国则尚未开展这方面的研究。     

显微分离黄鳝单条染色体用于基因定位

在倒置显微镜下显微分离了黄鳝56条单染色体,以兼并寡核苷酸为引物进行PCR扩增,并将其DOP－PCR产物作为探针进行染色体反向描绘,描绘结果表明,已对黄鳝1,3,5,6,7,10和12号染色体获得了成功的分离。随后,把这些染色体DNA的DOP－PCR产物列阵点于尼龙膜上,作为“特定染色体DNA池”（specifical chromosomal DNA pool0用于黄鳝基因定位,定位结果显示：Zfα基因位于1号染色体,rDNA基因位于3号和7号染色体,GH和PDEGγ基因位于10号染色体,HSL基因位于5号染色体,并在1,3,6和10号染色体上同时检测到Hox基因杂交信号,据此还初步推测了部分保守同线群,为鱼类基因定位和杂色体进化研究提供了一种新的可行方法,也为鱼类核型研究中以分子标记确认每条染色体提供了新思路。     

核酸酶S1介导的缺失基因探针的富集

基因组DNA的递减杂交(genomic subtaction)是根据变性的DNA双链,在一定的条件下可以复性(再结合)的特性设计的,是分离缺失或扩增DNA片段的简单而有效的方法.Lamar等率先用来克隆了人Y染色体特异的基因探针.Kunkel等和Nussbaum等分别用该方法克隆了DMD(Duchenne muscular dystrophy)和脉络膜缺损(choroidermia)座位的探针.二者都是利用了X染色体上这两种疾病座位的大片段缺失,但对于一些小范围的缺失,如小于100kb,单纯的递减杂交就难以有效地富集这种缺失的DNA.     

人类遗传病基因治疗的现状与展望

自70年代中期以来,虽然人类在征服癌症等"不治之症"的战斗中付出了巨大努力,但却很少有成功的记载.然而现在,科学家们正从一不同的角度出发探索新的治疗途径,取得了令人瞩目的进展.70年代后期,遗传工程技术不断更新,尤其是限制酶位点多态性(RFLP)、寡聚核苷酸探针(ASO)以及聚合酶链式反应(PCR)等技术的相继问世,使得基因诊断技术突飞猛进.RFLPs只是因人而异的短短的DNA序列,可以测定出它在染色体中的特定位置;     

NF1基因附近一个新的STR位标的分离和鉴定

用人工合成的 (dC_dA) 15 寡聚核苷酸探针 ,从 1 7q1 1_q1 2区带显微切割探针池中分离得到一个含有 (CA)重复单位 1 6次的DNA片段 ,经在GenBank和GDB中检索确认是一个新的STR .这个新的STR在 5 0名中国人中存在 8种等位形式 ,多态信息量值高达 0 6 1 .连锁分析显示这个STR在一个 3代的NF1病人家系中的传递符合Mendel遗传规律 .用含有这个新的STR的 1 7kb的人基因组DNA片段为探针进行FISH ,将其定位在 1 7q1 1_q1 2区带 ,即NF1基因所在的区域 .这个新的STR的GenBank和GDB注册号分别为 :G32 1 1 2和D1 7S2 2 0 4.     

王百合单染色体DNA文库的构建

以王百合为模式植物建立了简单快速分离植物单染色体及扩增和克隆其DNA的方法 ,即显微操作分离单个染色体并放入Eppendorf管中 ,经Sau 3A酶切后在染色体DNA片段两端加上Sau 3A寡核苷酸人工接头 ,然后以寡核苷酸人工接头中的一条链为引物进行两轮PCR扩增 .PCR产物为 30 0～ 2 50 0bp ,多数为10 0 0bp左右 ,经Southern杂交证实PCR产物来自王百合基因组DNA .对单染色体第二轮PCR产物进行克隆 ,构建单染色体DNA文库 ,得到约 10 0 0 0 0个重组子 .对其中 84个重组子进行分析 ,插入片段为 30 0～180 0bp ,平均为 780bp .与以往方法相比 ,此方法避免了在纳升体积内酶解、连接等操作 ,扩增底物只需一条染色体而不是以往的几十条 ,而且克隆片段 (平均 780bp)大于以往的报道 (平均 6 50bp) .     

棉属D基因组棉种着丝粒FISH标记的筛选初报

为了筛选着丝粒探针, 在棉花染色体荧光原位杂交中标记染色体着丝粒区域, 以便于构建棉花粗线期染色体细胞遗传学图谱. 在棉花遗传连锁图上选择尽可能接近着丝粒区的单拷贝的分子标记, 以海岛棉pima 90-53的BAC文库为素材, 采用两维筛库法从该文库中筛选BAC克隆, 然后用BAC-FISH技术进行染色体定位检测. 用10号染色体长臂末端的SSR引物BNL3563筛选到一个BAC克隆150D24, 该克隆在四倍体陆地棉和海岛棉部分染色体着丝粒区有杂交信号, 但信号强度不高. 以二倍体D基因组为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区有明显信号, 但是以二倍体A, C, E等基因组棉种染色体为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区未发现杂交信号. BAC克隆150D24可能含有D组特有卫星重复序列, 可用作棉属D基因组棉种(包括四倍体棉种D亚组)的着丝粒FISH探针.     

棉花GISH-NOR的初步探讨

在以棉花基因组DNA(gDNA)为探针的基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)实验中, 观察到6个NOR(nucleolar organizer region)信号. 在对草棉或陆地棉的同一有丝分裂细胞分别进行以45S rDNA和gDNA为探针的原位杂交中, 发现以gDNA为探针所产生的NOR信号与以45S rDNA为探针所产生的NOR信号在数目、位置以及大小方面极其相似甚至相同, 由此将以gDNA为探针所产生的NOR命名为GISH-NOR. 在棉花GISH-NOR中, 陆地棉和雷蒙德氏棉全部为端部类型GISH-NOR, 而对于草棉变种阿非利加棉则为4个端部类型和2个着丝粒类型GISH-NOR. 陆地棉6个GISH-NOR中的2个位于A亚组染色体上, 其余的4个位于D亚组染色体上. 在以雷蒙德氏棉为靶DNA, 以其本身gDNA为探针的GISH中, 观察到6个GISH-NOR信号. 而在以阿非利加棉为靶DNA, 以其本身gDNA为探针的GISH中, 没有观察到GISH-NOR信号, 并且有一对染色体长臂近一半区域不显示信号. 在以陆地棉为靶DNA, 阿非利加棉为探针时发现, 如果用D基因组棉种作封阻, 则不出现GISH-NOR信号; 如果改用鲑鱼精DNA作封阻, 则出现GISH-NOR信号. 而在以D基因组二倍体棉种戴维逊氏棉为探针时, 即使用A基因组棉种作封阻, 也能观察到6个GISH-NOR信号. 对于这种现象, 可能由2种原因造成, 即rDNA的同步进化和D基因组棉种gDNA中的rDNA含量多于A基因组棉种. 此外, 还观察到陆地棉染色体上的所有GISH-NOR信号全都位于染色体短臂端部.     

用Y染色体特异的DNA探针于妊娠早期鉴定胎儿性别

重组DNA技术已应用于多种遗传病的产前诊断,并成功地用来鉴定胎儿的性別,国内已运用这种技术进行α-和β-地中海贫血的产前诊断,但是胎儿性别的鉴定仍沿用染色体分析,本文介绍用Y染色体特异DNA探针于妊娠早期鉴定性别。本法具有快速、灵敏等优点,对于X-连锁遗传病的产前诊断具有重要价值。     

脱氧核酶在生物检测及基因治疗中的研究进展

脱氧核酶(DNA zyme)是通过体外筛选技术获得的有酶活性的单链DNA分子.随着越来越多的脱氧核酶被筛选出来,科学家对其功能性质的研究也逐渐深入.其中,RNA切割作用作为脱氧核酶最重要的一种特性,是目前研究热点.而脱氧核酶发挥RNA切割作用需要辅因子(金属离子、中性分子、细菌等),因此,基于此特性,DNAzyme不仅被广泛用于金属离子和生物分子检测,而且被应用于特异性切割mRNA阻断蛋白的翻译,从而用于多类临床疾病的治疗.本文系统总结了DNAzyme在金属离子和生物分子检测以及在基因治疗方面的研究进展,并对其在动物体内对目标分子的高灵敏度、低浓度特异性检测及发挥切割活性进而达到疾病治疗做出了展望.     

纳米金颗粒在石英晶体微天平检测DNA中的表面修饰作用

采用石英晶体微天平(QCM)技术, 用不同粒径的纳米金颗粒来进行QCM的表面修饰, 提高对单链靶标DNA的检测灵敏度. 在相同的实验条件下, 通过研究5~60 nm范围内不同粒径纳米金颗粒对QCM表面的修饰作用发现: 金颗粒粒径的大小对DNA探针在石英晶体微天平表面的固定量和DNA的杂交率均有影响. 20 nm粒径的金颗粒对QCM表面修饰作用为最佳, 能最好地提高DNA检测灵敏度.     

分子信标核酶探针用于核酶切割反应的实时监测

发展了一种新型分子信标核酶探针用于核酶切割反应的实时监测. 该探针由核酶底物修饰构建而成, 它将核酶切割反应的信息实时同步转换为荧光信号. 与已有研究方法比较, 是一种非同位素标记、高灵敏高特异的核酶切割反应实时监测方法. 为核酶活性分析、核酶动力学研究提供新型有效的手段, 也为核酶在基因治疗中的深入研究提供了全新的方法和思路. 应用该探针, 快速、实时监测了丙型肝炎病毒核酶的切割效率.     

用基因组总DNA做探针产生动物DNA指纹图

DNA 指纹图技术自1985年问世以来,已成为法医学上个体识别和亲缘鉴定的有力工具,而且还广泛地用于研究动植物甚至微生物的群体遗传和进化、以及重要性状的遗传连锁分析.常规的 DNA 指纹分析需要采用特定的 DNA 指纹探针,它们主要为多位点小卫星探针(multilocus minisatellite probes)和微卫星探针(microsatellite probes).目前应用最广的DNA 指纹探针包括人源小卫星探针33.6,33.15,α-珠蛋白-3′HVR;细菌噬菌体 M13;微卫星(TG)_n、(GTG)_n 等.然而,并非任何单位都能获得这些探针,而且制备探针 DNA 既     

遗传疾病和它们的基因

1983年春,诺贝尔奖金获得者David Baltimore形容一项DNA重组技术的新操作尚处于“胚胎状态”。不料6个月后,James Gusella领导的研究小组报导说,他们利用这项限制性内切酶切割DNA技术,发现了在第4染色体上的亨丁顿(Huntington)氏病(一种无法治疗的神经系统进行性变性)基因的一个标记物。     

一种方便、无PCR过程的DNA shuffling方法

目前大多数的DNA shuffling方法都需要PCR过程. 由于一些限制内切酶的识别位点与切割位点不重叠而产生不同的黏性末端, 当再连接的时候, 同源片段之间就可以混合起来按照正确顺序组装成新的嵌合体分子. 利用这种性质, 构建了一种新的、无PCR过程的、简便的shuffling方法.     

多探针扫描探针显微镜研究进展与应用

扫描探针显微镜(SPM)是微纳尺度形貌表征、物性测量及微纳操作的重要工具之一.传统的SPM只有单一探针,功能单一,多探针扫描探针显微镜(MP-SPM)的出现拓展了SPM的应用.MP-SPM的多个探针可充当精确定位的测量电极,从而提供了一种无损探测样品微纳尺度电学输运性质的方法;也可相当于多只独立活动的"手",相互配合实现复杂的纳米操作;还可以探针成像,成像信息作为其他探针操作的先验/反馈信息,从而提高操作的效率及准确性.本文首先介绍了MP-SPM的基本仪器结构,多探针距离缩小及位置标定方法,以及使用多探针技术测量材料电阻率的原理,接着总结了近年来MP-SPM在样品微纳尺度电学输运性质测量、微纳操作、并行成像与操作以及新型力学性质测量等方面的应用,最后探讨了该技术的前沿发展以及面临的机遇与挑战.     

用多聚酶链式反应快速检测转化细胞中外源人凝血因子重Ⅸ cDNA

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用人工合成的寡聚核苷酸引物和DNA多聚酶进行体外DNA扩增,这是近年迅速发展起来的分子生物学技术。这一技术已在基因诊断、突变检测、多态性研究和核苷酸顺序分析等方面得到应用。在基因转移和基因治疗中,常常有必要对转化细胞进行DNA分析,检测区分外源DNA和基因组DNA。常规用的方法不仅需要大量细胞,而且需要同位素标记的探针和Southern杂交,整个过程既麻烦又费时。本文介绍我们用PCR技术,对转有外源基因——人凝血因子IX cDNA的血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞和其他转化细胞进行的直接检测和DNA分析。     

利用纳米金颗粒增强DNA探针在传感器上的固定程度和识别能力

近年来,纳米颗粒已广泛应用于生物体系的研究,利用双硫醇分子作为连接剂,将纳米金颗粒固定于金片上,利用石英晶体微天平（QCM）技术研究了DNA探针在金片上的固定,并对DNA的识别能力进行了初步的探讨。在实验条件下,经过纳米颗粒修饰的金片对HS－DNA探针的吸附量比未经修饰的金片可提高3－5倍,并将传感器的灵敏度提高约3倍至0．35μg/mL。     

不同环境介质中溴化乙锭的三维荧光光谱研究

溴化乙锭(EB)是一种应用于DNA研究最常用及较理想的荧光探针.由于仅双链DNA能使EB的荧光明显增强,EB常用来作为双链DNA的结构探针.在一定意义上,生物大分子可以认为是一种有序化介质,在不同类型有序介质中EB的三维荧光光谱特征将可以更好地帮助理解EB与DNA的作用机理.因此系统研究EB的荧光特性具有一定的意义.本文研究了不同环境介质中EB的三维荧光光谱特性,这是文献未见报道的.实验发现EB在阴离子胶束十二烷基硫酸钠(SDS)、非离子胶束聚氧化乙烯(9,5)对-特辛苯酚(Triton     

利用C基因组C0t-1 DNA比较分析稻属A, B, C, D基因组

以药用野生稻(CC) C₀t-1 DNA作为探针, 对其自身体细胞染色体和栽培稻×药用野生稻杂交后代F1, 回交后代BC₁以及宽叶野生稻(CCDD), 高秆野生稻(CCDD)和斑点野生稻(BBCC)体细胞染色体进行荧光原位杂交实验. 在药用野生稻体细胞染色体中, 同源染色体呈现相似的C₀t-1 DNA杂交带型, 并对其核型进行了同源性聚类. 对F₁ (AC)和2个BC₁ (AAC和ACC)的杂交实验中, 在不封阻的情况下, 药用野生稻C基因组C₀t-1 DNA探针能清晰地鉴别C组染色体, 而在A组染色体上信号分布很少, 说明A基因组与药用野生稻C基因组中高度重复序列同源性较低. 此外, 对宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻3个四倍体体细胞染色体进行了FISH分析, 在24条C组染色体上均可观察到较强的杂交信号, B和D基因组的24条染色体上信号较少, 但在D组染色体上的信号较B组染色体的多, 说明D与C基因组的亲缘关系较B与C基因组的近. 进一步分析发现, 高杆野生稻D组染色体上的杂交信号要比宽叶野生稻D组染色体上的杂交信号多, 说明高杆野生稻的D基因组与C基因组的同源性要高, 这可能是高秆野生稻和宽叶野生稻同属于CCDD染色体组型但可区分为不同种的原因之一. 上述结果表明, C₀t-1 DNA具有很强的种的特异性和依赖基因组型的特异性, 利用C₀t-1 DNA作探针更能有效地对不同基因组进行FISH鉴定. 同时, 本研究采用F₁植株和BC₁植株, 即1个二倍体和2个三倍体人工选育杂种, 与宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻进行了基于C基因组C₀t-1 DNA杂交的比较分析, 对稻属异源四倍体的可能起源机制进行了初步探讨.