微管剪切蛋白Fidgetin在黑腹果蝇 神经发育过程中的功能初探

微管(microtubule,MT)是一种具有极性的细胞骨架.在微管动态变化过程中,有两类蛋白参与微管组装和解聚的动态调节.Fidgetin(Fign)的编码基因为CG3326,它是其中的去组装因子之一,参与微管剪切和末端解聚.本实验使用CRISPR/Cas9系统,构建fidgetin无功能突变体果蝇品系(fidgetin~(null)),观察fidgetin功能缺失对果蝇的神经发育的影响.结果表明fidgetin~(M14-2)会导致神经肌肉突触(neuromuscular junction,NMJ)的扣结数增多.通过观察fidgetin~(M14-2)的表型从而初步判断fidgetin基因对神经系统发育的影响,为fidgetin基因功能与致病机制的进一步研究提供基础.     

用CRISPR/Cas9系统构建原位表达dXPR1-GFP的果蝇品系

XPR1是最近鉴定出的一个原发性家族性脑钙化症(primary familial brian calcification,PFBC)的致病基因,它在果蝇体内的同源基因是CG10483(dXPR1).使用CRISPR/Cas9系统,构建原位表达dXPR1-GFP的果蝇品系,在CG10483终止密码子之前插入绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的编码序列,使果蝇表达dXPR1-GFP融合蛋白.该融合蛋白既可以被CG10483编码蛋白的抗体和GFP的抗体识别又能在激发光下发出绿色荧光,能为dXPR1编码蛋白提供准确的定位,从而为研究XPR1基因的功能提供方便.     

用CRISPR/Cas9系统构建dXPR1的果蝇突变体品系

XPR1是一种细胞无机磷酸盐输出蛋白的编码基因,其突变会导致原发型家族性脑钙化(primary familial brain calcification,PFBC). XPR1在果蝇中同源基因为CG10483(d XPR1).使用CRISPR/Cas9系统,通过构建引导Cas9内切酶的sgRNA表达载体,并将其注射到表达Cas9酶的果蝇卵中,构建了d XPR1大片段缺失果蝇品系即d XPR1无功能突变体(d XPR1-).通过观察d XPR1-的表型从而初步判断XPR1基因对神经系统发育的影响,为进一步的XPR1基因功能与致病机制的研究提供基础.     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接,构建CREPT基因敲除质粒;体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体;体外切割实验结果显示,以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。     

基于核酶的自剪切sgRNA及其在基因编辑中的应用

为减少在CRISPR/Cas9基因编缉系统中,sgRNA通常由Ⅲ型启动子持续转录产生,Ⅲ型启动子不易控制,sgRNA持续表达又容易产生细胞毒性这一缺陷,本文拟建立由Ⅱ型启动子转录,并由内含子中释放sgRNA的方法.我们在sgRNA的两端设计了三种核酶-sgRNA-核酶的组合,通过核酶的自剪切作用实现sgRNA的释放.实验结果表明,HHRz-sgRNA-HDVRz的设计能够正确的从内含子中释放sgRNA,并且该sgRNA在构建的copGFP敲除模型中能够实现有效的基因编辑.这一发现证明在哺乳动物细胞中利用Ⅱ型启动子,在核酶和内含子剪切的协助下可以实现sgRNA的表达,这为Cas9和sgRNA整合在一个Ⅱ型启动子之下实现组织特异性和药物诱导性表达提供了基础.     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测,本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统,根据PPARD基因结构和序列特点,设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列,将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞,提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后,通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现,PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比,PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体,并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑,将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率,推进对PPARD基因的功能研究。     

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型

目的 利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性OGA在成体心脏稳态维持中的功能。方法 首先,筛选靶向Oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^Cas9),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgOga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测Oga的表达情况,确定Oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析Oga对心脏稳态维持的影响。结果 筛选到2条可以有效靶向Oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了Oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论 利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞Oga基因敲除的小鼠模型,为研究OGA介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功...     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种

以头孢菌素C(CPC)工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C(DCPC)累积,提高CPC产量与质量.首先,构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解.然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA,构建Ac-ΔcahB∷cefG...     

基于CRISPR/Cas9系统构建Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞系

为构建Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞系(Lewis lung carcinoma, LLC),本文利用CRISPR/Cas9技术,在CHOPCHOP网站筛选Slfn2基因的sgRNA序列,将合成的oligo序列退火后连接至pLenti CRISPR v2质粒中,并与pMD2.G、psPAX2共转染至293T细胞中包装慢病毒;利用包装的慢病毒感染LLC细胞,经筛选和单克隆培养,获取Slfn2^-/-敲除的LLC细胞。结果显示：SgRNA成功插入载体重组质粒;利用3质粒包装的慢病毒成功将LLC中的Slfn2基因突变,获得丢失8个碱基移码突变和丢失180个碱基缺失突变的Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞。可见,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞。     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9基因剪刀而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9基因剪刀而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9基因剪刀而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9基因剪刀而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

基因编辑综合实验设计与实践

基于本科生科研创新能力的培养需求,该文设计了"利用CRISPR/Cas9技术对哺乳动物细胞进行基因编辑"这一探究性综合实验,将原创性前沿科学研究引入到学生的实验教学中.通过该实验课程的学习,学生能够掌握一定的生物信息学知识以及分子生物学、生物化学和细胞生物学相关的常规科研方法和手段.实践表明,通过相对完整的科研探索,该...     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用

CRISPR-Cas系统是新近在原核生物中发现的一种抵御外来DNA入侵的免疫机制,由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成,广泛分布于真细菌和古菌中.CRISPR由重复序列及其间隔序列组成,间隔序列来自于过去的入侵DNA,并插入到细菌的CRISPR排列中.一旦出现新的入侵,CRISPR转录,其RNA经过加工后与Cas蛋白质组成一个核蛋白复合体,该复合体通过RNA与入侵DNA序列之间的互补配对,结合目标序列,最后Cas蛋白质将入侵DNA降解.此外,基于CRISPR系统中的Cas9蛋白,发展了一种新的基因组编辑技术,在不同的细胞中均能获得高效的基因定点打靶,展现出巨大的潜力.     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...