丹参酮Ⅱ A通过调控PKC/CyclinD_1通路抗大鼠心肌成纤维细胞增殖作用研究

目的观察丹参酮ⅡA(TaishinoneⅡA,TSN)和蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱(Chelerythrine,Chele)抗血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱发的心成纤维细胞(Cardiac fibroblast,CFb)增殖、细胞周期、Ⅰ型胶原纤维(CollagenⅠ)、PKC和细胞周期蛋白Cyclin D1表达的影响,阐明TSN抗CFb增殖的分子机制.方法培养的新生Wistar大鼠CFb分为对照组、AngⅡ组、Chele+AngⅡ组、Chele+AngⅡ+TSN组和AngⅡ+TSN组,胰酶消化、差速贴壁培养CFb,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;免疫细胞化学染色(IC)法测定Collagen I含量;流式细胞仪(FCM)检测细胞周期;免疫印迹法(WB)检测PKC和细胞周期蛋白Cyclin D1表达.结果与AngⅡ组比较,Chele和TSN组及Chele+AngⅡ+TSN组能显著降低CFb增殖率(P0.05或P0.001),降低CollagenⅠ含量(P0.05或P0.01),提高CFb G0/G1期细胞百分比,降低S期细胞百分比(P0.05或P0.01),抑制PKC和Cyclin D1蛋白表达(P0.05或P0.01).结论 TSN和Chele能显著抑制由AngⅡ诱导的CFb增殖和胶原蛋白分泌,其机制可能是通过抑制PKC-Cyclin D1传导通路实现的.     

重楼皂苷Ⅶ抑制PC3细胞的增殖和周期阻滞的研究

探讨重楼皂苷VII (PolyphyllinVII, PP7)对人前列腺癌PC3细胞增殖和周期的影响及其机制.采用Cell Counting Kit-8(CCk-8)方法观察PP7对PC3细胞增殖的影响.流式细胞术研究PP7对PC3细胞周期的作用.培养 PC3细胞并给予0.33和 0.5 μg/mL的PP7. 经过24 h后,采用Western blot法检测周期相关蛋白Cy-clin D1和p21的表达变化.结果表明,PP7可明显抑制 PC3 细胞增殖,并呈明显的浓度依赖性,其IC 50 值为(0.67±0.02) μg/mL;PP7可上调PC3细胞p21的表达,下调Cyclin D1的表达. PP7将PC3细胞周期阻滞于G1期是通过上调p21,抑制Cyclin D1周期调控蛋白的表达实现的.     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

水飞蓟宾通过上调P15~(INK4B)和P21~(WAF1/CIP1)活化JNK诱导人胰腺癌细胞G1期阻滞及细胞凋亡

目的:探讨水飞蓟宾对胰腺癌As PC-1细胞的增殖抑制作用及其作用机制.方法:MTT法和克隆形成抑制实验观察水飞蓟宾对人胰腺癌As PC-1细胞的增殖抑制作用,碘化丙锭(PI)单染色检测细胞周期改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blotting检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达.结果:不同浓度的水飞蓟宾对胰腺癌As PC-1细胞的生长均有抑制作用,且呈剂量-效应和时间-效应关系(P0.05),水飞蓟宾作用于As PC-1细胞48、72 h的IC50浓度分别为224.20、87.25μmol/L;克隆形成抑制实验显示,随着水飞蓟宾浓度增加,As PC-1细胞克隆形成逐渐减少.细胞周期检测结果显示,随着水飞蓟宾浓度的增加,胰腺癌As PC-1细胞出现明显G1期阻滞;水飞蓟宾处理组细胞的周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E2、Cyclin A、Cyclin B1表达下降,细胞周期蛋白激酶CDK4、CDK6表达不变,细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白P15INK4B、P21WAF1/CIP1表达升高,与流式检测的结果相一致.不同浓度水飞蓟宾作用48 h后,出现明显的凋亡细胞群;同时发现Caspase-9、Caspase-3活化降解,Caspase3下游效应蛋白PARP出现切割条带.JNK蛋白表达增加并磷酸化活化,Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L、Mcl-1表达明显降低,促凋亡蛋白Bax表达基本不变,BH3-only蛋白Bclxs、Bid、Bim表达增加.结论:水飞蓟宾明显抑制胰腺癌细胞增殖,通过诱导P15INK4B、P21WAF1/CIP1表达阻滞细胞周期在G1期,并通过诱导JNK活化激活线粒体细胞凋亡途径,进而诱导胰腺癌As PC-1细胞凋亡.     

重楼活性单体PP-26抑制结肠癌SW620细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的:探讨重楼活性单体PP-26对人结肠癌SW620细胞增殖抑制作用及其机制.方法:采用噻唑蓝(MTT)法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体PP-26对人结肠癌SW620细胞增殖抑制作用;PI单染及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡水平;Western blotting检测PP-26对细胞周期、细胞凋亡相关蛋白以及Akt和ERK蛋白的表达.结果:与正常肝LO2细胞相比,重楼单体PP-26能显著抑制SW620细胞的生长,作用呈剂量-效应关系;随着PP-26浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与细胞对照组相比有显著差异;不同浓度PP-26作用后,细胞阻滞于G1期;PP-26作用细胞24 h后,CDK4、CDK6表达下降,P15、cyclin D1表达增加;不同浓度PP-26作用后,细胞晚期凋亡率增加,随浓度增加有上升趋势;PP-26作用细胞24 h后,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase-9、Caspase-3表达下降,PARP切割条带增加,细胞促凋亡蛋白Bax的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x L减少,p-Akt和p-ERK蛋白表达均下降.结论:重楼活性单体PP-26通过上调p15促进结肠癌SW620细胞阻滞于G1期,通过抑制P13K/Akt信号通路及ERK信号通路,活化线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡.     

IRS1在藻蓝蛋白介导的H460细胞增殖和迁移调控中的作用

藻蓝蛋白来源于海洋藻类,是我国认可的食品着色剂和功能型食品．初期研究表明,藻蓝蛋白处理能抑制人类非小细胞肺癌系H460的体外增殖能力和迁移能力,使得其体外集落形成能力减弱．通过转录组学测序分析进一步探究具体作用机制,从藻蓝蛋白处理前后发生显著变化的基因中,筛选出了一个藻蓝蛋白处理后发生显著下调的基因,即胰岛素受体底物1（irs1）,并通过体外转染siRNA的方法抑制IRS1的表达,来研究其对非小细胞肺癌系H460的增殖和迁移能力的影响．采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布．结果表明,下调IRS1的表达后,与对照组相比,细胞的生长速率降低,迁移能力、集落形成能力受到抑制,同时使细胞周期被阻滞到G1期．PI3K-AKT信号通路研究表明,藻蓝蛋白处理使得PI3K-AKT信号通路活性受到抑制,下调IRS1的表达使得PI3K-AKT信号通路部分蛋白表达也下调,通路活性受到一定程度抑制．本研究结果表明,藻蓝蛋白抑制非小细胞肺癌系H460体外活性功能的机制,可能与IRS1的表达和PI3K-AKT信号通路的活性有关,这为藻蓝蛋白的调控机制提供了有力的理论基础．      

氰戊菊酯对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

通过加入PD98059(细胞外信号调节激酶阻断剂)后探讨氰戊菊酯诱导乳腺癌细胞增殖的作用机制.观察加入PD98059前后氰戊菊酯诱导的细胞增殖情况,采用MTT法,流式细胞仪测定周期法,流式细胞仪法观察ERα蛋白、ERK蛋白和p-ERK1/2蛋白表达情况.氰戊菊酯能够明显升高MCF-7细胞的S期细胞数,作用程度与雌二醇相似,并且通过降低ERα蛋白表达量,升高p-ERK蛋白表达量促进MCF-7细胞的增殖;加入PD98059后,S期细胞比例降低,ERα蛋白表达量升高,p-ERK蛋白表达量降低,MCF-7细胞的增殖降低.氰戊菊酯通过ERK细胞信号转导通路发挥促细胞增殖作用.     

过表达Vav1蛋白对乳腺癌细胞系T47D细胞增殖的影响

Vav1是造血系统中的重要蛋白,具有鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)活性,能够催化Rac/Rho GTP酶的活性,从而参与众多的细胞事件,如细胞骨架重组,基因的转录,免疫细胞的发育和活化,细胞增殖和凋亡等.近年来,在包括乳腺癌在内的人类癌症中均发现有Vav1的表达,但对于Vav1在乳腺癌细胞中的具体功能和机制仍不清楚.本研究中,通过慢病毒包装系统感染乳腺癌细胞系T47D构建了稳定表达Vav1的乳腺癌细胞系,通过WST-1检测细胞增殖和细胞流式法检测细胞周期发现Vav1能够促进细胞增殖,同时通过蛋白免疫印迹技术和报告基因系统发现这一过程可能跟Vav1增强转录因子NF-κB转录活性上调细胞周期相关蛋白Cyclin D1相关.     

Cyclopamine对牛脂肪间充质干细胞细胞周期相关基因表达的影响

间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力,能在体外诱导成脂细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞等.脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)取材方便,来源较为丰富.本试验利用hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine(CPA)对牛AMSCs的细胞分裂周期机制做了初步探讨.先用血清饥饿法使细胞处于G0/G1期,再经CPA处理,检测不同处理时间的细胞周期蛋白cyclinA、cyclinD和cyclinE的表达情况.经CPA处理的细胞,其周期蛋白cyclin A、cyclin D和cyclin E的表达水平显著低于对照组.表明,CPA通过抑制细胞周期蛋白基因的表达从而抑制了细胞的增殖.     

鹿角帽水溶性提取物双相调节乳腺癌细胞增殖

初步探讨SAB抑制乳腺癌增殖的剂量特征和机制.采用MTT法检测不同浓度SAB对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,进一步利用RT-PCR、Western blot等方法观察细胞周期蛋白、细胞凋亡相关因子、ER-α36、ER-α66等表达的变化.结果显示,低剂量(0.25mg/mL)的SAB促进MCF-7细胞的增殖,高剂量的SAB才能抑制MCF-7细胞的增殖,促进细胞凋亡,并且将细胞周期阻滞在S期.提示SAB通过影响不同ER亚型的表达介导不同的ER信号通路,从而起到对乳腺癌细胞的双相调节作用.     

骨形成发生蛋白对人骨髓间充质干细胞的影响

目的探讨骨形成发生蛋白(BMP)对人骨髓间充质干细胞的影响及调节作用.方法使用含BMP-7基因的PTracer-CMV载体感染人骨髓间充质干细胞(h MSCs),并设未转染组和空载体组,免疫组化法检测BMP-7蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,湿化学法检测碱性磷酸酶合成情况.结果培养48 h后,BMP-7转染组h MSCs增殖速度明显高于未转染组和空载体组,差异具有统计学意义(P0.05);未转染组与空载体组h MSCs增殖速度之间比较差异无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组各时间点G_0/G_1期细胞比例均明显低于未转染组和空载体组;S期、G_2/M期的细胞比例均明显高于未转染组和空载体组,上述差异具有统计学意义(P0.05);各时间点未转染组与空载体组G_0/G_1期、S期、G_2/M期细胞比例间差异均无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组h MSCs细胞碱性磷酸酶含量明显高于未转染组、空载体组,差异具有统计学意义(P0.05).结论 BMP-7可促进h MSCs体外增殖和向成骨细胞分化,可能与促进细胞由G_1期进入S期、DNA合成增加、提升DNA合成的后期细胞数量有关.     

对香豆酸抑制肺癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡的机制研究

探究了对香豆酸（p-coumaric acid,p-CA）对人肺癌细胞细胞A549和H1299增殖、凋亡和迁移的影响及作用机制.结果显示,添加0～10 mM p-CA能显著抑制两种肺癌细胞的生长和迁移,并呈剂量和时间依赖性（P<0.001）. p-CA显著抑制了细胞周期发生,并将细胞周期阻滞在G1期,且细胞凋亡发生明显增加（P<0.05）. p-CA显著抑制了CDK2、CDK6、Cyclin D1等周期正调控因子表达,并诱导细胞周期负调控因子p21、p27等基因的表达上调;与此同时,p-CA还诱导了促凋亡因子Bax表达上升和抗凋亡因子Bcl-2表达水平的降低且caspase-3和caspase-9的表达上调,而对迁移相关基因表达的检测结果也显示p-CA抑制了β-连环蛋白（β-catenin）的表达并促进钙粘附蛋白E(E-cadherin)表达上升.上述结果表明,p-CA具有抑制肺癌细胞生长、诱导凋亡并抑制其迁移的作用,它主要是通过促进Bax、caspase-3、caspase-9、p21、p27、E-cadherin等蛋白的表达而抑制Bcl-2、Cyclin D1、β-ca...     

细胞膜去极化通过激活MAPK信号通路促进原代肌母细胞增殖

细胞膜去极化可促进某些细胞包括肌卫星细胞的增殖,但去极化对于肌母细胞的作用还不清楚.本文通过培养基中高浓度的钾离子(K~+)引发小鼠原代肌母细胞膜的去极化,采用直接计数法评估细胞的增殖能力.结果显示,在K~+浓度为25 mmol/L的培养基中培养24 h后,肌母细胞数量较常规培养基(5 mmol/L K~+)明显增加,但K~+高至50 mmol/L和100 mmol/L时对细胞增殖没有促进作用.通过流式细胞技术进行细胞周期分析显示,25 mmol/L K~+处理使G1期的细胞数量减少,S期的细胞数量增加.免疫荧光染色和Western blot研究发现,25 mmol/L K~+处理后,对肌母细胞的肌分化能力没有影响.进一步研究发现,25 mmol/L K~+明显促进了肌母细胞MAPK信号通路(ERK1/2)的激活,并与其促进细胞增殖的效应相关. MEK1/ERK1/2的两种抑制剂U0126和PD98059均可减弱细胞膜去极化引起的细胞增殖促进效应.综上,研究结果表明细胞膜去极化通过激活MAPK通路促进小鼠原代肌母细胞的增殖.     

Apelin-13通过ERK_(1/2)信号通路促进MCF-7细胞的增殖及侵袭

采用MTT、Brdu流式细胞术,Transwell侵袭实验,ElISA、Western blot检测实验研究了apelin-13对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭的影响.结果表明:apelin-13能够激活ERK1/2信号传导通路,上调Cyclin D1和MMP-1的表达,进而促进MCF-7细胞的增殖及侵袭,可为临床乳腺癌的诊断、防治及愈后评估提供新的思路和方法.     

趋化素样因子1对肾癌细胞ACHN生物活性的影响及其相关机制

多项研究发现,趋化素样因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1)是人类多种肿瘤发生和进展的重要调节因子。然而,关于CKLF1对肾癌细胞生物活性的影响知之甚少。通过质粒转染实现CKLF1在肾癌细胞ACHN中过表达,探究CKLF1对肾癌细胞ACHN细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。将实验组pEGFP-N1-CKLF1和对照组pEGFP-N1真核细胞表达质粒分别转染肾癌ACHN细胞,实现趋化素样因子1在ACHN细胞中的过表达。利用荧光显微镜,镜下观察质粒转染效率。利用细胞计数试剂盒8(cell counting Kit-8,CCK8)观察肾癌细胞ACHN转染24、48、72 h后增殖情况;利用流式细胞术检测ACHN细胞转染24、48、72 h后细胞周期的变化情况;利用Hoechst33258染色法观察转染48 h后,ACHN细胞形态变化,利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用Western blot法检测CKLF1过表达后,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Bcl-2样蛋白1(Bcl-2 like 1,Bcl-xL)、信号传导及转录激活因子3(signal t...     

非小细胞肺癌FOXP3与P53突变的关联及其对Cyclin D1和CDK4的表达调控作用

目的 探讨叉头蛋白3(FOXP3)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达、与P53突变的关联及其对Cyclin D1和CDK4表达的调控作用.方法 采用免疫组织化学染色法检测NSCLC组织中FOXP3和突变型P53(mt-P53)蛋白表达的相关性,应用脂质体转染法将FOXP3 siRNA瞬时转染到A549细胞中.实验分为A549组、Control-siRNA组和FOXP3-siRNA组.Real-time PCR和Western blotting方法检测FOXP3沉默效果,MTT方法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期情况,Western blotting方法检测Cyclin D1和CDK4的表达水平.结果 NSCLC组织中,FOXP3阳性表达率为64.0%,mt-P53阳性表达率为56.0%,二者之间的表达呈显著正相关关系(r=0.342,P=0.015).与A549组和Control-siRNA组相比,FOXP3-siRNA组FOXP3 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01),细胞增殖明显减慢(P<0.01),G₀/G₁     

ATX在LPC诱导胃癌细胞增殖与迁移中的作用

利用免疫组化技术研究ATX在胃癌及正常人胃粘膜组织之间表达的差异,Western Blot法检测ATX表达及ERK磷酸化,MTT法测定细胞增殖,Boyden chamber法测定细胞迁移.结果显示:ATX在正常胃粘膜组织、癌旁组织及胃癌组织均有表达,胃癌细胞BGC-803中有表达;ATX具有溶血磷脂酶D活性,能将LPC水解为LPA,并以LPA受体介导信号通路促进胃癌细胞的增殖和迁移作用.由此得出LPC是通过LPC-Autotaxin-LPA-LPA1/3-Gi-ERK信号通路诱导胃癌细胞增殖与迁移.ATX/LPA通路在胃癌治疗中也是一个潜在的靶位点.     

PI3K等5条信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调节作用研究

为从基因转录水平解析信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调控作用,用小鼠基因表达谱芯片Mouse Genome 4 302.0检测信号通路相关基因表达丰度发现,PI3K,STAT3,钙蛋白酶,Rho家族鸟苷酸激酶和VEGF等5条信号通路的105个基因在该细胞的细胞周期中发生有意义的表达变化.分析基因表达变化预示的信号通路作用表明,上述5条信号通路依次促进G1期、G1/S转换期、S期、G2/M转换期和M期进程.结论:上述5条信号通路促进NIH3T3细胞的细胞周期进程.     

Cyclin D1与p21WAF1在鼻咽癌中的表达

目的探讨鼻咽上皮癌变过程中周期蛋白CyclinD1与抑癌基因p21（wild—type p53 activated fragment 1,p21wAF1）蛋白的表达及其意义。方法应用免疫组化方法检测47例鼻咽癌组织、21例癌旁上皮组织和14例正常鼻咽粘膜中Cyclin D1与p21WAF1蛋白表达。结果从鼻咽正常粘膜、癌旁粘膜上皮组织到癌组织,Cyclin D1表达阳性率逐渐增加,并且差异有显著意义（均为P〈0．05）。p21WAF1蛋白在以上组织中阳性率较高,且各组间差异无显著性。结论Cyclin D1、p21WAF1蛋白与鼻咽部上皮细胞恶性增生密切相关,p21wA兀蛋白表达可能与细胞周期调控的反馈机制有关。     

rhBMP-2对SD大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究

目的:通过观察重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖、骨向分化能力的影响,以及对内源性因子TGF-β1、Smad4和下游细胞因子Cbfα1的作用,阐释其对MSCs骨向分化影响可能的作用机制.方法:运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠MSCs;运用MTT法检测质量浓度分别为0、5、10、20、40、80、100ng/mL rhBMP-2对SD大鼠MSCs增殖活性的影响;以碱性磷酸酶(ALP)活性及ALP染色阳性率确定rhBMP-2的最佳促MSCs骨向分化浓度,并以该浓度对MSCs骨向分化进行干预.按是否添加经典成骨诱导液将实验分为:空白组,经典组,rhBMP-2组,rhBMP-2+经典组.通过检测ALP、I型胶原(Col I)、骨钙素(BGP)和钙化结节的表达,以评价各组骨向分化能力;通过检测TGF-β1、Smad4、Cbfα1 mRNA的表达,以评价各组促MSCs骨向分化的作用机制.结果:rhBMP-2的最佳促MSCs增殖质量浓度为80 ng/mL,最佳促MSCs骨向分化质量浓度为40 ng/mL.经典组和rhBMP-2诱导各组均能促进MSCs骨向分化,刺激TGF-β1分泌,并上调Smad4、Cbfα1 mRNA的基因表达,而TGF-β1在早期分泌量最高,提示其可能在MSCs早期骨向分化过程起重要作用.结论:rhBMP-2诱导各组均有促MSCs骨向分化的作用,可能是通过促进TGF-β1的分泌,启动TGF-β超家族/Smads信号通路调控MSCs的骨向分化.