实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎

目的比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响。方法利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株。然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率。结果胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3%vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05)。结论通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚。     

小鼠体细胞核移植及ES细胞样集落分离

利用小鼠皮肤成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植并从重构胚中分离胚胎干细胞(ES)样集落,以便对体细胞核移植重构胚来源的ES细胞样集落进行研究.结果显示,小鼠皮肤成纤维细胞作为核供体,核移植重构胚激活率为60.48%(254/420),囊胚发育率为6.90%(29/420),6个囊胚中分离出ES细胞样集落,分离率为1.43%(6/420),3个ES细胞样集落能够稳定传代,至第5代时核型正常率分别为77.84%,75.18%,77.20%.分离出的ES细胞样集落具有岛屿状团状隆起结构,碱性磷酸酶染色呈阳性,体外可自发分化成上皮样或梭形细胞.实验证实小鼠唇部皮肤成纤维细胞能够支持体细胞核移植重构胚发育至囊胚,并能分离出可以稳定传代的ES细胞样集落.     

双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立

以经SspI和BamHI对所构建的双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB双酶切后的线性目的DNA为外源基因,对电击介导的牛胎儿成纤维细胞基因转染方法的效率进行了优化.实验结果表明,当电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms时可获得约50个阳性细胞克隆/10 5 个细胞的最佳转染效率.通过牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418抗性的敏感性实验确定800μg/mL G418为快速筛选浓度,以300μg/mL G418为维持筛选浓度.从两个牛胎儿成纤维细胞系中共分离了56个绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞克隆,从中选取2个冷冻保存.经PCR检测,证实2个冷冻克隆株均含有所转染的外源基因.     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

奶牛胎儿细胞多位点基因打靶的研究

利用奶牛rDNA基因间的ITS重复序列作为靶位点,对奶牛胎儿成纤维细胞进行多位点基因打靶,建立以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,并为克隆定点转基因奶牛提供核供体。首先分离培养出奶牛胎儿成纤维细胞,并进行性别鉴定和核型分析。采用MTT比色法确定了G418和GCV正负筛选的最低有效浓度。然后通过多位点基因打靶载体转染、正负筛选获得7个表达绿色荧光的克隆细胞系,经PCR,RT-PCR和测序证实其中1个细胞系为定点整合的克隆细胞系,且GFP基因表达。     

利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚

以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植,结果发现：阿菲迪霉素可有效将胎儿成纤维细胞同步于G0／G1期;以GFP阳性细胞进行核移植,其卵裂率、囊胚率与对照组间无显著差异（P〉0．05）,所构建的重组胚,2-细胞阶段观察不到GFP的表达,4-细胞以后GFP的表达逐渐增强,在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达,将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植,获得1例妊娠;黄牛卵母细胞-水牛供核细胞构建异种重组胚囊胚率显著高于黄牛供核细胞-水牛卵母细胞构建的异种重组胚（P〈0．05）,并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达,GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记．     

人肝细胞再生增强因子双顺反子表达载体的构建及表达

PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体pAIE.另外体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblast cells,sFFCs),脂质体lipofectAMINETM介导pAIE转染sFFCs,经过筛选后形成单克隆细胞,RT-PCR和免疫组化方法进一步检测ALR基因的表达.进一步将转基因细胞饥饿培养,体外成熟培养绵羊卵母细胞146个,进行体细胞核移植,经融合、激活后,在培养液中进行发育培养,对发育到8细胞胚胎在激光共聚焦显微镜下观察;同时利用免疫组化检测ALR基因在胚胎中的表达.结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因在sFFCs内同时存在并表达;得到45个8细胞体细胞克隆胚胎,其中14个发育形成囊胚,EGFP和ALR基因在体细胞克隆胚胎中同时存在并表达.因此由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可减少检测目的基因的繁琐手段,可得到高纯度表达ALR基因的转基因细胞和胚胎,为生产药用蛋白治疗肝脏疾病奠定实验基础.     

ω-3转基因克隆绵羊诞生

我们构建了含有bfat-1表达载体pIE-bF1,通过脂质体介导转染获得转基因细胞系,再以核移植技术获得转基因克隆胚胎。胚胎移植后,于2010年10月27日出生两只克隆羊。经检测均为转ω-3基因克隆绵羊。     

腺病毒载体介导的GFP在鸡胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉

鸡胚成纤维细胞（CEF）是多种动物及人类病毒的易感细胞;也是研究鸡的基因组功能的理想材料．本试验的目的是研究非复制型腺病毒载体对CEF的转染效率及安全性;并建立在CEF细胞中进行RNAi的技术平台．采用GFP重组非复制型腺病毒载体（Ade-GFP）转染CEF细胞：结果证明0．1．2000 MOI Adv-GFP均可转染CEF细胞并表达GFP;转染后16h开始出现GFP阳性细胞：胞核与胞浆可见明亮的荧光：荧光细胞数量及荧光强度在24～36h达到高峰：以后逐渐衰减;约180h全部消失;转染效率最高为22.3％;形态学观察及流式细胞仪测定结果显示：Adv-GFP转染的CEF细胞未见细胞病变;多数转染组细胞活力不受影响：说明用Adv-GFP携带外源转染CEF细胞是安全可行的;用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA;成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在鸡胚成纤维细胞的表达：干涉效率为85％：证明了鸡胚成纤维细胞中存在RNAi机制：为进一步利用非复制型腺病毒载体递送siRNA在CEF细胞内进行RNAi的研究奠定了基础．     

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

原核显微注射产生转基因绵羊胚胎

体外采集绵羊卵丘卵母细胞复合体,成熟培养24 h,经过体外受精培养17 h,比较高速离心对胚胎发育的影响;高速离心可以使黑色脂滴甩到一边从而使受精卵原核清晰可见.然后将绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子和真核细胞表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)的载体DNA显微注射于绵羊受精卵雄原核中,并将异构胚在SOF液中发育培养.结果表明:高速离心组囊胚率低于对照组,但是没有显著性差异(P》0.05);显微注射外源基因2天后在激光共聚焦显微镜下可见荧光胚胎;PCR检测5个荧光胚胎均可见特异性条带.在原核显微注射生产转基因胚胎中,绿色荧光蛋白可作为标记基因进行早期胚胎筛选,为提高转基因动物移植效率奠定实验基础.     

转基因和再克隆对克隆胚胎细胞凋亡的影响

细胞凋亡在着床前胚胎发育过程中发挥着重要作用,胚胎凋亡检测能为获得高质量的体细胞克隆胚胎提供有益信息,进而有助于提高克隆效率.用原位末端标记法对牛的转基因克隆和转基因再克隆囊胚进行了细胞凋亡检测,再克隆囊胚是利用转基因克隆牛的体细胞作为供体细胞进行体细胞核移植后获得的第二代克隆胚胎.结果表明转基因克隆胚胎的囊胚发育率显著低于非转基因克隆胚胎的囊胚发育率,而转基因克隆囊胚的细胞凋亡指数显著高于非转基因克隆胚胎的细胞凋亡指数.此外,转基因再克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数与非转基因克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数相比差异性不显著.结果表明早期的转基因克隆胚胎发育能力的减弱可能是由于供体细胞的基因转染和药物筛选过程导致的,而再克隆对其早期胚胎的发育能力没有负面影响.     

人工合成启动子特异启动IGF-1真核载体的构建与绵羊成纤维细胞转染

构建了肌肉特异表达IGF-1载体,并转染绵羊成纤维细胞获得了稳定整合外源基因可用于细胞核移植的转基因细胞.通过人工合成骨骼肌特异启动子SP片段,与羊IGF-1相连,最终连接到骨架载体pCDsRed2中构建成骨骼肌特异表达IGF-的真核表达载体pSPICDS.使用脂质体法转染绵羊成纤维细胞,通过红色荧光与G418双重选择,获得了转基因细胞.经PCR检测证实得到的细胞克隆外源基因稳定整合,可以作为供体细胞用于体细胞核移植.     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

hBSP与GFP非融合表达载体的构建及乳腺癌细胞转染条件优化

为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和流式细胞仪筛选获得稳定转染细胞.结果发现:在96孔板中,细胞融合度达到90%;用1μg脂质体介导280 ng重组质粒转染10 h,转染效率最高可达(19.70±1.10)%.     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞。转染后36h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件。结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05)。当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0。这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础。     

阳离子脂质体介导基因转染的实验教学改革

通过优化细胞转染条件,探讨脂质体与DNA的复合比例、复合时间以及转染时间对脂质体介导的基因转染效率的影响。实验采用凝胶阻滞电泳分析脂质体完全包裹DNA时二者的复合比,通过转染绿色荧光蛋白报告基因(pEGFP)研究脂质体/pEGFP的复合比例、复合时间对细胞转染效率的影响。激光扫描共聚焦成像进一步分析转染时间对细胞摄取DNA量的影响。实验结果表明,脂质体和DNA的复合比例为1.25时,细胞的转染效率最高。转染4 h后,大量DNA被细胞摄取,此时可以更换新鲜的培养基。     

昆明鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的：从昆明系小鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞(ES细胞)．方法：收集小鼠3．5d胚龄的囊胚，将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，5—6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养，观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、原位杂交、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定．结果：KS细胞集落性生长，符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性．结论：昆明系小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞，并能进行传代培养．     

过表达BMP7对HL-7702细胞功能的影响

目的建立HL-7702细胞BMP7基因转染细胞系,并检测其增殖和迁移能力的变化。方法脂质体介导方法转染细胞,采用RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达以评价其转染效果;用MTT、划痕实验检测转染后增殖及迁移能力的变化。结果成功建立转染细胞系,转染BMP7基因后HL-7702细胞增殖和迁移能力有所增强。结论 BMP7基因高表达可能是肝细胞癌变的原因之一。