生殖域中特异表达的新基因Rcet2的克隆

利用NCBI中的数字差异显示数据库首先电子克隆了Rcet2基因,然后从成年小鼠睾丸组织中克隆出Rcet2全长基因,序列分析显示：Rcet2基因全长cDNA为454 bp,含3个外显子,编码88个氨基酸残基,该蛋白含1个不完整的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用是重要的.小鼠多组织RT-PCR结果显示,Rcet2在成年老鼠大脑、睾丸和附睾生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet2与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征,结果显示Rcet2可能是Cres亚家族中的一个新成员.     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

PCNA基因在小鼠睾丸发育过程中的表达研究

为探讨PCNA基因在小鼠睾丸生后发育全过程中的表达规律,以16组出生后不同发育时期的昆明种正常小鼠睾丸组织为材料,在其石蜡组织切片上进行PCNA蛋白的免疫组化检测及PCNA基因的DNA-mRNA原位杂交检测.结果发现:PCNA蛋白仅在精原细胞及初级精母细胞中表达,其表达峰值出现在小鼠生后第11天;PCNA基因在初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞以及少数精原细胞中均有表达,其中初级精母细胞中的表达信号相对强烈.上述结果表明,PCNA基因参与了小鼠睾丸发育过程中精原细胞及初级精母细胞的DNA复制过程,其mRNA表达和蛋白质表达存在着一定差异.     

小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究

 以1天龄、未成熟(3周龄)、成熟期(10周龄以上)的昆明正常小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的Si1基因探针在其组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交,探讨Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达变化.同时,分别在生后15,20 d及25 d的昆明小鼠睾丸组织切片上进行凋亡细胞原位检测,验证小鼠睾丸上述发育时期的细胞凋亡情况.结果发现:①Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号;在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内有极强的杂交信号;在成熟小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号.②小鼠睾丸组织生精上皮内,凋亡细胞数从生后第15-20天呈增加趋势,于生后第20天出现峰值,生后第25天又降低.上述结果表明Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用,由于Si1基因的表达与小鼠生精细胞凋亡发生的时期同步,表明该基因可能与小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡有关.     

一条在人睾丸中高表达的新的环指蛋白(RNF20)

从人胎脑构建的cDNA文库中,通过大规模测序筛选的方法获得一条新基因,该基因蛋白序列含有1个环指（RING finger)基序及2个进核信号（nuclear localization signal NLS)序列,钭此基因命名为RNF20（RING Finger 20),用放射杂交细胞系（Radial hybrid RH)方法定位此基因在人染色体的9q22上,Northern杂交表明,其mRNA在睾丸组织中高表达,用小鼠睾丸做原位杂交表明,小鼠的同源基因在精原细胞及初级精母细胞中高表达,未成年小鼠睾丸中的精原细胞没有发达,提示RNF20可能参与精子发生的调控作用。     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

小鼠睾丸发育过程中Ki67蛋白的表达规律

为探讨Ki67蛋白在小鼠睾丸生后发育全过程中的时空表达规律,以20组处于不同发育阶段的昆明种正常小鼠睾丸组织为材料,在其石蜡组织切片上进行Ki67蛋白的免疫组织化学检测.结果发现:Ki67蛋白在生后1d直至58d的小鼠睾丸组织中均有表达,其表达部位集中于精原细胞和部分初级精母细胞,其中精原细胞中的表达相对强烈;其表达活跃时期出现于小鼠生后7~25 d.上述结果表明Ki67蛋白参与了小鼠睾丸正常发育过程中精原细胞的有丝分裂过程,可作为评估睾丸精原细胞增殖活性的指标之一.     

睾丸组织高表达新基因THE的克隆及表达特征分析

以Homo.sapiens brain为库,选取编号为CA423810的EST序列,联网到NCBI调用Blast服务器分析,该EST序列是一个代表新基因的未知序列.以该序列作为电子探针,通过Internet采用Blast软件进行GenBank的EST数据库检索,获得了该序列的电子延伸产物EST重叠群.经与人类基因组草图进行序列校正,获得了全长为2 232bp的cDNA序列.利用NCBI的ORFfinder服务器,分析发现该序列具有完整的阅读框架,从而确定了基因的全长cDNA序列.该基因定位于染色体上的5q22,编码由388个氨基酸组成,分子量为44859的蛋白质.运用RTP-CR技术,以新基因电子克隆全长cDNA序列设计基因特异性引物,以11例癌组织及相应的正常组织的cDNA、人胎脑cDNA文库和人睾丸cDNA文库为模板扩增目的片段,并以看家基因GAPDH为内对照,检测目的基因的mRNA表达水平.研究结果表明,新基因只在睾丸组织中高表达,在直肠癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌等的癌组织及相应的正常组织中都无明显的表达.因此将该新基因命名为睾丸组织高表达基因(testis high expression,THE).以上结果提示,THE基因可能是在人脑中表达的同一基因的不同剪接本.关键词检索UniGene数据.     

黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.