穿梭质粒pNBC11的构建及性质研究

质粒 pUB110与 pUC18分别册 EcoRI 酶切,T_4DNA 连接酶进行连接,得到重组质粒 pBC11。琼脂糖凝胶电泳分析,该质粒分子量为4.8×10~6道尔顿。pBC11是一种穿梭质粒,能转化大肠杆菌和枯草杆菌,它对大肠杆菌 C600、JM101的转化率分别为:4×10~5、1.5×10~5转化体/μgDNA.对枯草杆菌 BR151、QB1130的转化率分别为1.5×10~3、2.15×10~3转化体/μgDNA。在基因表达方面,pBC11上的 K_m~r 基因能在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达,但 pBC11的 Ap~r 基因不能在枯草杆菌中表达。     

大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术,将大麦黄矮病毒抗性基因制酶基因ＯＲＦ２插入Ｔｉ质粒ｐＧＡ４８２的Ｔ－ＤＮＡ区,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌／质粒系统。     

运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas．mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种;但由于其可利用的碳源范围窄,所以对其进行基因工程改造首先需要有较好的载体系统．以Z．mobilis内源质粒pZM2和大肠杆菌(E．coli)质粒pBR328、pACYC184为出发质粒,构建了三个Z．mobilis-E．coli之间的克隆型穿梭质粒,即pZB1、pZB21和pZB31．对它们在Z．mobilis CP4中的稳定性、拷贝数的初步比较分析表明：pZB21最稳定、拷贝数最高,pZB31次之,pZB1最差．进一步以pZB21为载体,在Z．mo- bilis CP4中表达E．coli的talB基因,酶活水平为0．087 U/mg蛋白．证明pZB21是能用于基因表达的、较为理想的Z．moblis-E．coli之间的穿梭载体．     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建

作者用DNA重组技术,构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4,它是以大肠杆菌(Es-cherichiacoli)质粒载体pUC18为骨架,与来自穿梭质粒表达载体pREP9含有革兰氏阳性菌复制起点(on     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

三种新的穿梭质粒pCC10、pCCT7和pST16的构建和性质研究

利用大肠杆菌质粒pUC18、pTG206和金黄色葡萄球菌质粒pC194在体外构建3个嵌合质粒pCC10、pCCT7和pST16.3个新质粒均是大肠杆菌和枯草杆菌的穿梭质粒。它们在大肠杆菌中呈Ap~rCm~r型,在枯草杆菌中则为Cm~rAp~5型。其中pCCT7和pST16含有xylE基因,可作为启动子探测质粒。所有的新质粒都具有来自pUC18的多酶克隆位点,适合于在大肠杆菌和枯草杆菌中重组外源DNA以及比较它们的表达情况。     

大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术 ,将大麦黄矮病毒抗性基因复制酶基因ORF2插入Ti质粒pGA4 82的T DNA区 ,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌 /质粒系统 .     

人肿瘤坏死因子穿梭表达载体的构建

应用ＤＮＡ重组技术,将人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ插到质粒ＰＲＬ４３９的ＰｐｓｂＡ启动子下游,得到中间载体ＰＲＬ＿ＴＮＦ;再把ＰＲＬ＿ＴＮＦ上含ＰｐｓｂＡ和（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ的片段连到穿梭载体ＰＤＣ＿８上,构建成穿梭表达载体ＰＤＣ＿ＴＮＦ．转化大肠杆菌ＴＧ１后,进行发酵培养．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分析和免疫印迹检测结果显示ｒｈＴＮＦ获稳定表达,分子量为１７ｋｕ．本研究结果为ｒｈＴＮＦ在蓝藻中的表达提供了技术基础．     

大肠杆菌—分枝杆菌启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建

报道了大肠杆菌－分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３的构建过程。证明其保留了在大肠杆菌和分枝杆菌之间的穿梭功能，并具有启动子筛选功能。利用构建的ＰＥＱ３质粒，从卡介苗染色体中筛选出了具启动子活力的ＤＮＡ片段。     

以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的构建

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒ）作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８,该基因的转录和翻译起始区以及５’－端编码区两个密码子均被除去,载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２,该标记基因的终止子来自Ｐｈａｎｅｒｃｈａｅｔｅｃｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ的ＬＩＰ６基因     

脱水蛋白DHN1表达载体pBV221-dhn1的构建及基因表达

以克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )为基础 ,构建脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.采用PCR技术从克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )上扩增dhn1片段 ,并引入NcoⅠ /BamHⅠ酶切位点 ,然后与 pBV2 2 1原核表达载体连接 ,得到 pBV2 2 1 dhn1表达载体 .阳性克隆经PCR和NcoⅠ /BamHⅠ酶切检测都得到 516bp的dhn1片段 ,且序列正确 .表达载体pBV2 2 1 dhn1转化宿主菌后能够表达产生相对分子质量为 2 2× 10 3的DHN1,该蛋白具有高温可溶性 .以上结果表明 ,本实验得到了高效表达的脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.     

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物（t—PA）基因并构建一种能高效、安全表达t—PA的pEGFP—N3-t—PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础．方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT—PCR获得t—PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP—N3和t—PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP—N3大片段（4．7kb）与t—PA基因片段（1．1kb）重组．对pEGFP—N3-t—PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定．脂质体介导pEGFP—N3-t—PA转染成纤维细胞（NIn313）,并用RT—PCR法从mRNA水平检测t—PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NH 3T3细胞中的表达．结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t—PA基因,并构建了以pEGFP—N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t—PA．结论含t—PA基因真核表达质粒构建成功．     

以淀粉酶基因为筛选标记的E.coli克隆载体的构建

以E．coli质粒pJRD184为基础,将多酶切点引入地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的a－淀粉酶基因信号肽编码区的PstI切点,构建了能表达并将a－淀粉酶（Amy）渗漏到胞外的E．coli克隆载体pLAM9712．该载体可根据在含有可溶性淀粉的LB平板上菌落周围有没有淀粉水解圈直接筛选重组子,从而避免了使用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D一半乳糖苷（X－gal）,代之以廉价的碘、淀粉．实验进一步验证了pLAM9712在基因克隆中的可行性及质粒本身的稳定性．     

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料，取幼叶分离mRNA，反转录合成cDNA，以cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate　Lipid　Dehydrolase，PLD)HKD2功能区的基因片段．对其进行Blast分析，结果表明，分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99．7％，只有2个碱基发生改变．将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940，构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD，为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础．