牦牛GSTK1基因序列特征分析及其组织表达谱构建

旨在探讨谷胱甘肽硫转移酶K1(Glutathione S-Transferase Kappa1,GSTK1)基因序列特征.以牦牛为试验对象,通过RT-PCR技术扩增GSTK1基因序列并分析生物信息学,采用RT-qPCR技术构建其在牦牛不同组织中的表达谱.ORF分析显示,牦牛GSTK1基因编码区为618 bp,编码氨基酸为205个.系统发育树分析显示,牦牛与野牦牛(99.68%)、黄牛(99.68%)和野牛(99.40%)之间的同源性最高,与北极熊(87.63%)、野猪(87.25%)和马(87.01%)之间的同源性最低.蛋白预测分析显示,GSTK1蛋白为不稳定的亲水蛋白,存在12个磷酸化位点.高级结构预测分析显示,GSTK1蛋白的主要成分为α-螺旋(50.73%)、无规卷曲(40.00%)和延伸链(9.27%).组织表达分析发现GSTK1在所检测牦牛卵巢、小肠、脾、肝、肾、肌肉、肺和心组织中均有表达,其中表达量最高的组织是肝,表达量最低的组织是脾和心,且与其他组织差异显著(P<0.05).本研究获得了牦牛GSTK1基因的序列特征及组织表达谱,为进一步挖掘牦牛GSTK1基因的功能提...     

牦牛PKN2基因克隆与组织表达特性的分析

克隆牦牛蛋白激酶N2(Protein Kinase N2,PKN2)基因编码序列(Coding sequence, CDS),预测和分析PKN2基因的生物学特性,并探究在不同的组织中的表达规律.以牦牛的脂肪cDNA为模板,用PCR技术克隆PKN2基因;使用MEGA7.0、SOPMA和TMHMM等进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR技术PCR分析牦牛PKN2基因在心脏、肝脏、脾脏等组织的mRNA水平的表达.结果显示,PKN2基因CDS区长942 bp,编码313个氨基酸,分子量为107 315.25 u,分子式C₄₇₄₂H₇₅₃₅N₁₃₁₉O₁₄₄₂S₃₈;PKN2蛋白为不稳定的亲水蛋白,具有101个磷酸化位点;跨膜结构预测显示不存在跨膜结构区和信号肽;PKN2的二级结构主要以α-螺旋(41.61%)为主;与其他物种的同源性分析结果显示,牦牛PKN2基因与普通牛的同源性最高(99.84%),与鸡的同源性最低(84.59%),符合物种进化规律.qPCR技术显示PKN2基因在牦牛脂...     

牛病毒性腹泻病毒牦牛株E0基因生物信息学分析及原核表达与抗原性检测

为研究牦牛BVDV E0蛋白的生物信息学及抗原性, 本研究对本实验室克隆并测序的牦牛病毒性腹泻病毒E0基因进行了生物信息学分析;同时用含有酶切位点、起始密码子、终止密码子的引物重新扩增E0基因, 并连接PMD18-T载体, 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后, 将获得的E0片段克隆至PET-28A原核表达载体, 构建重组质粒并转入JM109.酶切、质粒PCR鉴定正确后转入rosetta(DE3)菌进行诱导表达.经SDS-PAGE检测结果显示目的基因获得了较高的表达, 表达的融合蛋白约33ku, 经western-blotting检测表明目的蛋白具良好的有抗原性.     

麦洼牦牛、西藏牛和荷斯坦牛C1QBP基因及其蛋白表达研究

补体1q结合蛋白(Complement C1q binding protein,C1QBP)通过与C1q结合,参与调控细胞免疫、代谢、氧化应激、凋亡等生物过程.研究通过RT-qPCR检测C1QBP基因在麦洼牦牛、西藏牛、荷斯坦奶牛的心脏、脾脏、肺脏、大脑、小脑组织中的相对表达量,利用Western blot检测C1QB...     

九龙牦牛CAST基因部分序列的克隆及其表达差异研究

根据牛钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST） 设计并合成一对引物,从九龙牦牛肌肉组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增获得九龙牦牛CAST基因部分片段,利用SQRT-PCR技术检测九龙牦牛各组织中CAST mRNA的表达差异．结果,成功克隆九龙牦牛CAST部分cDNA序列485bp,获得GenBank登录号为FJ483833;用DNAman软件分析发现九龙牦牛CAST基因与普通牛的核苷酸同源性依次为99％;SQRT-PCR组织表达检测表明,CAST基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪中均表达,在心脏中表达最高,在脂肪组织中表达最低．     

牦牛雌激素受体ERα和 ERβ 基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异。根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布。结果表明,分别获得2 100 bp ERα(GenBanK登录号：KJ011123)和1 791 bp ERβ(GenBanK登录号：KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸。多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5% 和 53.9%-99.1%。荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ。此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低。而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之, 心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低。本研究为进一步了解牦牛ERα 和 ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础。     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

山羊PGRMC1基因序列分析及表达特性分析

旨在克隆获得山羊PGRMC1基因序列,并明确该基因的生物学特征,阐明其在山羊各组织及诱导分化不同阶段皮下脂肪细胞中的表达模式.利用RT-PCR技术克隆获得山羊PGRMC1基因序列,通过生物信息学方法分析其生物学特性;通过实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测其在各个组织及不同分化阶段皮下脂肪细胞中的表达水平.结果显示,克隆得到山羊PGRMC1基因序列1 024 bp,其中CDS区585 bp,共编码194个氨基酸,是主要定位于细胞质、细胞核以及线粒体的酸性亲水性不稳定蛋白;分析显示山羊PGRMC1的核苷酸序列与其他物种如绵羊、牛、猪、羊驼、猩猩、人、马、猫、骆驼、狐狸相似程度为88.79%～99.69%不等,说明该基因在不同物种中具有高度保守性;构建进化树显示,山羊PGRMC1与绵羊亲缘关系最近,与马的亲缘关系最远,符合物种进化规律;组织表达谱显示,PGRMC1在山羊心、肝、脾、肺、肾、背最长肌中广泛表达,其中在肝脏中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),其次是在背最长肌和脾脏中的表达水平...     

赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据.以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测.成功克隆出赤狐ESR1基因5'上游1880 bp...     

牦牛ATF4基因组织表达与雌性生殖器官中定位分析

旨在克隆牦牛转录激活因子4(ATF4)基因,并检测其在不同组织的表达及雌性生殖器官中定位分析,探索ATF4在母牦牛繁殖的影响.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛ATF4基因CDS序列,生物信息学分析牦牛CDS区,RT-qPCR检测ATF4基因在牦牛不同组织中的表达模式,免疫组化(IHC)分析ATF4蛋白在雌...     

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.     

我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析

设计一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’，下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆了来自我国甘肃、青海和云南地区牦牛β乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，甘肃牦牛与青海牦牛该序列的核苷酸同源性为98、13％，与云南牦牛该序列的核苷酸同源性为97．65％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．45％。     

杨小舟蛾MtroOBP1基因的克隆、序列分析及表达

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是一种嗅觉相关的蛋白,该蛋白参与大多数气味分子的识别过程,并与气味分子相结合。获得杨小舟蛾[Micromelalopha troglodyta (Graeser)]OBPs以明确其特性。【方法】选择羽化后健康的杨小舟蛾触角为模板,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆杨小舟蛾MtroOBP1基因,利用生物信息学分析软件研究其基因序列和蛋白结构,运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究MtroOBP1的组织表达模式。【结果】利用RT-PCR技术从杨小舟蛾触角总RNA中扩增得到MtroOBP1基因(GenBank登录号:MN056510),序列分析表明,MtroOBP1开放阅读框为777 bp,一共编码了258个氨基酸残基,且翻译的氨基酸序列仅含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的OBP基因的编码蛋白不属于典型气味结合蛋白家族,而是属于Minus-C家族。蛋白质理化性质预测显示:MtroOBP1蛋白的分子量为29 664.57 u,等电点为6.23,有18个潜在的磷酸化位点,没有明显的跨膜区,疏水指数为-2.011~3.078,有一个由19个氨基酸组成的信号肽,说明为分泌型蛋白。组织表达模式表明MtroOBP1在杨小舟蛾的各部位都表达,但在触角中表达量最高。【结论】首次克隆得到杨小舟蛾MtroOBP1基因,在触角中高表达,推测其蛋白具有运输气味分子的功能,在杨小舟蛾的嗅觉识别中起着至关重要的作用。     

锌指结构基因HKR1在脑胶质瘤中的表达分析

从人胎脑cDNA文库中筛选到2612nt的锌指蛋白HKR1克隆,C端含有10个C2H2锌指结构,N端含有2个KRAB区域,基因芯片的原位杂交检测显示,HKR1基因表达在脑胶质瘤中明显升高,提示该基因可能是一条潜在的肿瘤相关基因。     

乳腺癌脑转移差异表达基因的生物学功能分析

乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastasis,BCBM)的发病机制尚未明确。为了探究BCBM的发病机制,对BCBM差异表达基因的生物学功能进行研究并筛选关键调控基因。从基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)下载4个BCBM基因表达谱数据(GSE12237、GSE100534、GSE125989以及GSE43837),采用R语言筛选差异表达基因,采用富集分析包括基因本体分析(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)进行生物学功能分析,采用STRING和Cytoscape分析蛋白质相互作用网络,采用Kaplan-Meier进行生存分析。结果表明,同时存在于2个及以上基因表达谱数据中的差异表达基因261个,GO分析主要涉及细胞外基质组织、细胞外结构组织等生物过程,细胞外基质结构组成、胶原结合等分子功能,含有胶原的细胞外基质、胶原蛋白三聚物等细胞组分;KEGG分析主要涉及蛋白质消化和吸收、局部黏附等通路。蛋白质相互作用网络分析得到9个关键调控基因,其中,DCN、COL6A1与BCBM的生存率显著相关,可作为潜在的BCBM关键调控基因,并为BCBM分子机制的研究提供思路。     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

陆地棉GhACS基因家族鉴定及表达分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS,EC 4.4.1.14)是乙烯生物合成过程的限速酶,对乙烯在高等植物体内的代谢调控具有至关重要的作用.本文通过系统发育分析和序列比对研究,鉴定出陆地棉基因组共编码22个GhACS基因,其编码蛋白含有7个与功能密切相关的保守基序,C末端具有多个潜在的Ser磷酸化位点;GhACS基因组织表达分析显示每个GhACS在棉花不同组织不同发育阶段表现出不同的基因表达谱,这些结果为进一步探究陆地棉GhACS基因家族的功能提供了有力的依据和参考.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.