乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因（nsr）。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。     

利用双向电泳技术分离乳酸乳球菌N8菌体蛋白

乳酸乳球菌N8是工业上生产细菌素nisin的重要生产菌株.利用双向电泳技术对乳酸乳球菌N8的菌体蛋白质进行了有效地分离,分析双向电泳图谱获得584个蛋白质点.通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析以及蛋白数据库检索,成功鉴定出其中6种乳酸乳球菌蛋白,为后续乳酸乳球菌蛋白质组学研究奠定了基础.     

培养条件对乳酸乳球菌N302合成乳酸链球菌素的影响

研究了培养条件对LactococcuslactisN302产生乳酸链球菌素的影响.结果表明,复合氮源、蔗糖、磷酸氢二钾、pH6.0和3%接种量有利于乳酸链球菌素的合成.发酵过程中菌体细胞生长、乳酸链球菌素活性和nisZ基因表达在培养21h达到最高峰,乳酸链球菌素活性为3560IU/mL.     

酸适应乳酸菌的筛选及其酸适应条件的研究

对24株包括双歧杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和保加利亚乳杆菌在内的4类乳酸菌酸耐受力进行评价,结果发现除4株保加利亚乳杆菌有较强的酸耐受力外,其余20株均为酸敏感菌株。将这20株酸敏感菌株酸适应（pH 4.5,1h）后,有13株菌的酸耐受力得到提高。其中,乳酸乳球菌KLDS4.0312酸适应能力最强,酸适应后其酸耐受力可提高7542倍。确定了乳酸乳球菌KLDS4.0312最佳酸适应条件为pH 4.5,30min,且稳定期的菌体酸适应后,酸耐受力仅能提高27倍,酸适应能力明显低于对数期菌体。     

Paenibacillus sp.K1 乳糖酶基因bga在乳酸乳球菌中的表达

为了提高乳酸乳球菌利用乳糖的能力,缓解乳糖不耐症,以实验室构建的含有乳糖酶基因的质粒pUC-bga为模板,通过PCR扩增得到乳糖酶基因bga,将其分别与载体pSEC和pMG36e连接,获得重组质粒pSEC-bga和pMG36e-bga,重组质粒分别电转Lactococcus lactis NZ9000和Lactococcus lactis MG1614,并在乳酸乳球菌细胞内实现了活性表达。高压液相色谱（HPLC）分析其对培养基中乳糖的利用能力,结果重组菌L.lactis NZ9000-Bga对乳糖的利用能力比对照菌株高一倍,为生产低乳糖的发酵乳制品奠定了基础。     

乳链菌肽发酵动力学研究

通过对乳链菌肽发酵过程动力学的研究,确定了乳链菌肽发酵过程的动力学数学模型,并通过实验数据验证了此模型的正确性。这将为今后进一步研究和预测乳链菌肽发酵过程奠定了一定的理论基础。     

乳酸乳球菌电转化条件的研究

以质粒pTRKH2为材料,对乳酸乳球菌MG1614进行电转化条件的研究.实验结果表明,在电转化过程中,电场强度、电阻大小、细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响,得到了乳酸乳球菌的最适电转化条件为:对数生长中期的细胞,经1%甘氨酸处理,在10kVcm电场强度、400Ω电阻下电转化,转化后细胞在SGM17培养液中培养2h后涂布选择性培养基,转化率(转化子个数与DNA质量之比)可达1.2×103个μg,比优化前的转化效率提高近100倍.     

响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究

乳酸乳球菌NZ9000是乳酸菌食品级高效蛋白表达系统中使用最广泛的宿主菌株。为获得高效的电转化效率,首先采用单因素试验,对影响NZ9000电转化效率的各因素:生长阶段、甘氨酸浓度、质粒浓度、电场强度、复苏培养和复苏时间进行优化;然后利用响应面法对其中的关键因素进一步优化,确定最佳电转化条件为吸光值OD600 0.2,甘氨酸浓度8 g/L和电场强度12.5 kV/cm,电转化效率达到3.76×10~7 CFU/μg DNA,比优化前提高了250%。本研究通过优化乳酸乳球菌NZ9000感受态的制备方法,提高了电转化效率,为深入挖掘乳酸乳球菌感受态潜力奠定了基础。     

抑制酸奶后酸化产细菌素乳酸菌的筛选及其产细菌素条件优化

乳酸菌所产细菌素是一种绿色、安全以及高效的天然抑菌物质,但产细菌素乳酸菌数量有限、产量低及价格昂贵等因素极大限制了细菌素的集约化应用.从传统发酵食品分离的16株乳酸菌中,通过微孔板法和琼脂扩散法筛选出一株具有明显抑菌效果的乳酸乳球菌株Q13,通过酸排除试验、过氧化氢排除试验、蛋白酶酶解试验和稳定性试验研究该菌株所产抑菌物质的生物学特性;对菌株产细菌素的发酵条件进行响应面优化,并对细菌素进行了初步应用试验.结果表明,菌株Q13所产抑菌物质是一种具有热稳定性和酸碱稳定性的蛋白类物质;其最优发酵条件为接种量1.4%、发酵初始pH 8.0、发酵温度27.5℃,此条件下,细菌素效价最高,可达618 AU/mL,比优化前200 AU/mL提高了3倍;Q13所产细菌素的后期添加可有效抑制酸奶后酸化,延缓酸奶酸度增加.该研究可为细菌素的工业化应用提供理论数据支撑.     

pH调控和蔗糖流加控制对乳酸链球菌素发酵的影响

研究了乳酸乳球菌发酵过程中pH调控和补料对产物生成的影响.研究采用三种不同的pH调控方式(初始pH7.0):(1)恒定pH6.8;(2)当pH降到6.2时恒定pH6.2;(3)发酵6 h后每2 h调节pH至6.8.结果表明,在发酵过程中按方式2调节pH与不调控pH相比,乳酸链球菌素效价提高了2.48倍.分别选用了4、5、6和8 g·(L-1·h-1)蔗糖流加速度,当按5 g·(L-1·h-1)恒速流加蔗糖溶液,乳酸链球菌素效价提高约2.9倍.     

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.     

乳酸链球菌发酵的系统计算

以乳酸链球菌代谢途径为基础,自动化生成了代谢物的标准化反应速率微分方程组,并建立了系统模型.在设定参数的情况下,计算得到了乳酸链球菌代谢物的浓度变化,量化了乳酸链球菌代谢过程.结果表明: 1)当菌量足够时,葡萄糖初值不同,不影响反应达到平衡所需时间和代谢物极值出现时刻;2)模型经改写,对突变菌株也适用,可以为菌株筛选提供指导,减少实验的盲目性与繁杂性.     

乳链菌肽产生菌P-99的摇瓶发酵条件

文章对天然生物防腐剂乳链菌肽产生菌——乳链球菌P-99的摇瓶细胞生长和发酵条件进行了研究,发现该菌株细胞的生长与发酵是同步的,最适种龄为8～18h,产乳链菌肽表现出初级代谢动力学特征;在M17培养基、30℃、起始pH6.5条件下发酵良好,通气量和Ca2+、Zn2+、Fe2+等金属离子对其细胞生长与乳链菌肽的合成无明显影响,但Mn2+对乳链菌肽的合成有促进作用,而Cu2+则有较强的抑制作用。     

乳酸链球菌素及其在肉制品中的应用

在肉制品的生产、加工乃至消费过程中,其防腐保鲜一直深受重视,人们期望能使用安全、绿色并对人体完全无害的添加剂.乳酸链球菌素是由Lactococcus lactic菌株产生的一种无毒副作用、热稳定的小分子多肽,能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖.研究显示,乳酸链球菌素既具有抑菌防腐作用,又具有一定的安全性,并已开始在食品行业大量应用,其作为安全的食品添加剂具有较佳的应用前景.     

人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上,在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明,发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用．