Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用蛋白质的筛选

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

耐辐射球菌抗氧化系统中的一个新成员dr1127

构建了一个耐辐射球菌(Deinococcus radioduran)未知基因dr1127的功能缺陷株MT1127. γ射线和H₂O₂处理R1和 MT1127的结果表明, dr1127基因的缺失影响了耐辐射球菌的辐射抗性和氧化抗性. 测试了指数生长期和稳定期的R1株和 MT1127株的细胞提取物活性氧自由基清除能力, 结果发现, 无论是超氧阴离子、H2O2还是羟自由基, MT1127株均表现为更弱的自由基清除能力, 这些结果与前面的生存率实验结果相吻合, 也在一定程度上帮助我们理解dr1127基因的功能. 同时, 在大肠杆菌BL21 (DE3)系统中成功表达了dr1127基因产物, 纯化得到46 kD的蛋白产物, 利用Fe²⁺-H₂O₂氧化损伤系统, 检测到DR1127蛋白在体外保护DNA免受氧化损伤的功能, 并测到该蛋白能通过结合双链DNA的方式来实现保护DNA的功能. 本研究揭示了dr1127基因在氧化损伤胁迫中的功能, 为耐辐射球菌庞大而又复杂的抗氧化系统增添了新的成员, 也为深入研究耐辐射球菌的超强辐射抗性开辟了一个新的研究思路.     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

Ras蛋白在组蛋白乙酰化修饰介导的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞周期调控中的作用

在天然同步化的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞中, 组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A (TSA) 阻断了细胞周期S/G2, G2/M以及走出有丝分裂期的转换, 同时影响了2种ras基因(Ppras1 和Pprap1)的转录以及Ras蛋白的表达水平. 抗Ras蛋白的抗体中和实验结果表明, Ras蛋白通过调节Cyclin B1的表达水平在细胞周期转换点的调控中起重要作用. 以上结果表明, 在多头绒泡菌细胞中Ras蛋白可能是参与组蛋白乙酰化修饰介导的细胞周期调控过程的一个关键因子.     

粉尘螨过敏原在转基因植物中的致敏活性分析

在转基因食品潜在致敏性的研究中, 将粉尘螨过敏原基因(Derf₂)引入植物中表达. 经PCR, Southern和Northern杂交以及ELISA检测证明, 外源基因已发生整合并正常表达, 表明转基因烟草作为一个实验系统来研究基因产物的致敏性是可行的. 同时, 采用RT-PCR从转基因烟草中扩增出经植物加工后的致敏原基因Derf₂片段, 序列比对证明植物(烟草)能对动物(粉尘螨)的内含子进行正确识别和有效剪切.     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

具有高比活性的新木聚糖酶XYNB的酶学性质研究及其编码基因的克隆和表达

纯化了橄榄绿链霉菌A1产生的胞外木聚糖酶XYNB, 并对其酶学性质进行了测定. XYNB具有优良的酶学性质, 最适pH为5.2, 最适温度为60℃, 比活性高达2869.78 U/mg, 对金属离子及EDTA和SDS等具有较好的抗性. 根据木聚糖酶成熟蛋白N端氨基酸序列测序结果设计引物, 克隆了此酶的成熟蛋白编码基因xynB. 基因全长576 bp, (G+C)含量为64.3%, 编码191个氨基酸, 理论分子量为20.839 kD, 是一种新的木聚糖酶基因. 构建了xynB表达载体并在大肠杆菌中得到了表达, 表达产物具有正常的生物学活性.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F₂群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

渗透胁迫调节拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3的基因表达

以拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3 (ATGPX3)的T-DNA插入突变体和转ATGPX3启动子GUS融合基因植株为材料, 深入分析了ATGPX3基因表达及其在渗透胁迫信号转导中的作用. 甘露醇渗透处理后, 与野生型拟南芥相比, ATGPX3基因突变体(atgpx3-1)的生长和发育明显受到了抑制; 并且渗透胁迫也提高了ATGPX3-GUS融合基因的表达. 在植物激素ABA诱导下, RD29A, ABI1, ABI2和RbohD等基因在atgpx3-1突变体中出现了不同程度的表达. 以上结果提示, ATGPX3可能参与了渗透胁迫反应的调节.     

水稻类病变突变体lmi的鉴定及其基因定位

水稻类病变突变体lmi(lesion mimic initiation)是从γ射线诱变的籼稻品种中籼3037的后代中发现的,属于起始型的类病变突变体. 无菌培养、台盼蓝染色及遮光实验表明, 该突变体受光照控制细胞自主性死亡. 遗传分析表明, 该突变性状由一对隐性基因控制. 利用lmi和93-11杂交的F2群体对lmi基因进行初步遗传定位, 发现该基因定位于水稻第8号染色体着丝粒附近的两个微卫星分子标记RM547和RM331之间, 与两者遗传距离分别为1.2和3.2 cM. 进一步利用这两个标记之间发展的CAPS标记 C4135-8, C4135-9及C4135-10对lmi基因进行精细的遗传定位, 结果表明, lmi基因与标记C4135-10共分离. 这一结果为克隆lmi基因奠定了基础.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.