新型靶向性药物VEGF-hFc的抗肿瘤研究

生物机体内天然存在许多受体与配体,它们之间亲和结合力远远高于抗体亲和力（Kd=10-8~10-9）.本实验根据VEGFR和VEGF之间的高亲和力（Kd=1.6×0-11）,以新生血管细胞表面的VEGFR为靶点,设计VEGFhFc融合蛋白作为靶向抗肿瘤药物.在本实验中构建pcDNA3.1IgG leader-VEGF-hFc重组载体,转染CHO/dhFr-细胞真核表达融合蛋白VEGF-hFc,并通过Protein A纯化.使用A549细胞构建人非小细胞肺癌裸鼠肿瘤模型,小鼠静脉注射10 μg VEGF-h     

帕珠沙星分子印迹聚合物结合特性

采用甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了具有高选择性的L-帕珠沙星分子印迹聚合物.印迹聚合物对模板分子的结合量明显高于空白聚合物.通过Scatchard分析研究了聚合物的选择结合性能,结果表明:分子印迹聚合物在识别帕珠沙星分子的过程中存在两类结合位点;用多点结合模型进行计算得到高亲和力的结合位点的离解常数Kd,1和最大表观结合常数Qmax,1分别为23.08 μmol/L和3.65 μmol/g,低亲和力的结合位点的离解常数Kd,2和最大表观结合常数Qmax,2分别为0.43 mmol/L和27.28 μmol/g.实验表明,分子印迹聚合物对模板分子的结合量高于其他类似物,呈现出空白聚合物没有的高选择性.     

FGF23通过FGFR4激活TGF-β通路促进心肌梗死后肾脏纤维化

目的 心肌梗死(心梗)常伴肾功能下降,然而其病理基础仍不清楚。本研究探讨成纤维生长因子23(FGF23)在心肌梗死小鼠肾脏纤维化进程中的作用,并阐明其作用机制。方法 通过外科手术结扎小鼠心脏前降支构建心肌梗死模型,利用小鼠心脏超声检测心功能变化,ELISA测定小鼠血浆FGF23水平,马松三色染色观察评估肾脏纤维化程度,免疫组化检测肾脏FGF23、成纤维细胞生长因子受体4 (FGFR4)和Klotho蛋白的变化,Western blotting检测小鼠肾脏组织和细胞中FGF23、FGFR4、Collagen I、Vimentin和TGF-β等蛋白的变化。结果 心肌梗死明显上调血浆和肾脏FGF23蛋白水平(P<0.05),心肌梗死后肾脏纤维化明显增加(P<0.05),肾脏FGF23、FGFR4、Collagen I、Vimentin和TGF-β蛋白水平显著上调(P<0.05)。然而,肾脏Klotho水平明显下调(P<0.05)。正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F)中得到了类似的结果,FGFR4抑制剂(BLU9931)可以降低纤维化相关蛋白的表达(P<0.0...     

TGF-β通过调控线粒体功能影响肺癌细胞的侵袭和迁移

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)在诱导肺癌细胞上皮-间质转化(EMT)的模型中对线粒体的影响与机制，以及线粒体功能受损对EMT的作用。方法:在TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT的模型中，利用流式检测线粒体膜电位及活性氧(ROS)水平，通过RT-PCR检测线粒体相关基因的表达；通过转化生长因子-β受体(TGF-βR)抑制剂和构建Smad2敲除的A549细胞，结合流式和RT-PCR手段验证TGF-β对线粒体调控的通路；利用RT-PCR和报告基因实验分析TGF-β对线粒体调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(PGC-1α)的影响；通过构建A549-tet-PGC-1α细胞检测PGC-1α诱导过表达对线粒体基因表达的影响；构建PGC-1α诱导敲低的A549细胞株，结合Western blot、RT-PCR、损伤修复和细胞迁移等实验分析PGC-1α敲低对细胞EMT的影响。结果:TGF-β显著促进线粒体膜电位(P<0.05)和ROS(P<0.001)水平，并抑制线粒体相关基因的表达(P<0.001),而TGF-βR抑制剂及Smad2敲低可抑制TGF-β引起...     

利福平分子印迹聚合物微球的制备及性能研究

以聚乙烯醇1735为分散剂、利福平为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,用水溶液微悬浮聚合法制备了利福平分子印迹聚合物微球;在水溶液中,利用静态平衡结合法和Scatchard分析法研究了印迹聚合物的结合能力和选择性.结果表明,利福平溶液的浓度范围在5×10-5~1×10-4mol/L内,所制得的印迹聚合物内存在两类不等价的结合位点,根据实验数据计算得到高亲和力结合位点的离解常数和最大表观结合量分别为Kd1=1.08×10-2mg/mL和Qmax1=14.40 mg/g;低亲和力结合位点的离解常数和最大表观结合量分别为Kd2=7.18×10-3mg/mL和Qmax2=12.51 mg/g.结合底物的实验结果表明,利福平分子印迹聚合物微球对利福平呈现出了较高的吸附性能和选择识别特性,能较简便地用于利福平的分离和富集.     

(S)-萘普生分子印迹聚合物结合特性及制备中复合物的性能研究

以丙烯酰胺为功能单体，合成了对(S)-萘普生具有高手性选择性的分子印迹聚合物．通过紫外光谱分析了聚合物制备过程中(S)-萘普生与功能单体丙烯酰胺形成的复合物，并用Hyperchem软件模拟其结构．分子印迹聚合物对模板分子的结合量高于其对映异构体，手性分离因子α达1．87．Scatchard分析表明分子印迹聚合物在识别(S)-萘普生分子过程中存在2类结合位点，计算得到高亲和力的结合位点的离解常数Kd．1和最大表观结合常数Qmax.1分别为28．0μmol／L和52．94μmol／g，低亲和力的结合位点的离解常数Kd．2和最大表观结合常数Qmax,2分别为0．489mmol／l和0．122mmol／g．     

乳铁蛋白对口腔癌细胞中VEGF和bFGF表达的影响

目的探讨乳铁蛋白对口腔癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)表达的影响.方法选用人口腔鳞癌细胞系CAL-27,分为0.006,0.013,0.025,0.050 g/L重组人乳铁蛋白实验组和空白对照组.应用RT-PCR法检测VEGF和b FGF mRNA表达水平;应用Western Blot法检测VEGF和b FGF蛋白表达水平.结果 CAL-27口腔癌细胞VEGF和b FGF mRNA均随着乳铁蛋白浓度增加表达量逐渐减少;0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF和b FGF mRNA表达量明显低于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05).CAL-27口腔癌细胞VEGF和b FGF蛋白产物随着乳铁蛋白浓度增加表达量逐渐减少;0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF,b FGF蛋白表达量明显低于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05).结论乳铁蛋白可有效抑制口腔癌细胞系CAL-27细胞中VEGF,b FGF的转录和表达,进而抑制血管生成,可作为乳铁蛋白抗口腔癌的机制之一.     

配合物分子印迹聚合物的识别性能

以乙酸镍和2,2′-联吡啶配合物为模板、4-乙烯吡啶为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了具有类似金属螯合抗体结合位点的金属配合物印迹聚合物,系统研究了金属离子对模板聚合物选择性结合2,2′-联吡啶的调节作用。结果表明:印迹聚合物对N i(Ⅱ)-2,2′-联吡啶配合物有选择性识别能力。采用Scatchard模型评价分子印迹聚合物的结合特性,得到高亲和力结合位点的平衡离解常数Kd1=0.082 mm o l/L,表观最大结合量Qm ax1=82.2μm o l/g,低亲和力结合位点的Kd2=0.400 mm o l/L,Qm ax2=91.3μm o l/g。     

野花生豆(Crotalaria mucronata)凝集素的细胞表面受体的研究

研究了异硫氰基荧光素和~(125)I标记的野花生豆凝集素,对A型细胞和牛精细胞表面的凝集素受体的定位、分布和数量。结果表明这些细胞表面的凝集素受体比较复杂,难以用一般动力学方法加以说明。D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和N-乙酰半乳糖胺等糖类和Con A、PHA、BSA对标记凝集素与A型细胞结合的影响各不相同。通过饱和曲线计算出A型细胞和牛精细胞表面的凝集素受体数目,分别为1.29×10~7和3.09×10~6个/细胞.     

基因工程人表皮生长因子（rhEGF）单克隆抗体的制备与初步鉴定

以基因工程人表皮生长因子(rhEGF)为抗原,免疫BALB/c小鼠,将免疫的小鼠脾细胞与小鼠Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行融合,经多次筛选和再克隆化,获得3株能稳定分泌抗rhEGF单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株.对该3株杂交瘤细胞小鼠腹水进行了抗体效价测定,结果显示在1×10-6～2×10-7之间.对上述3种杂交瘤单抗(分别命名为:AE-2A4,AE-2G5和AE-3E11)进行了特异性、抗原决定簇及相对亲和力测定.结果表明,它们都具有抗rhEGF高特异性;并分别抗两个不同抗原决定簇;相对亲和力大小次序为:AE-3E11>AE-2A4>AE-2G5.Ig亚类鉴定结果显示:AE-2A4,AE-3E11同为IgG1亚类,而AE-2G5为IgG2b亚类.确定AE-2A4单克隆抗体可用于制备高纯rhEGF.     

异丙肾上腺素诱发大鼠特异性心肌缺血所引起心肌细胞病理组织的变化

目的 观察皮下注射不同天数异丙肾上腺素(1 mg/kg体质量)诱发大鼠特异性心肌病所引起心肌组织切片HE染色、VEGF(血管内皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)表达及心电图T波的变化。方法 除空白组外各组大鼠皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg),分别为连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)2 d组、连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)4 d组、连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)6 d组。给药1周后,大鼠麻醉,测心电图,取心脏,采用HE染色观察大鼠心肌细胞损伤程度的变化,采用免疫组化技术染色观察心肌组织切片VEGF(血管内皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)表达的变化。结果 与空白对照组相比连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)6 d组HE染色组织切片镜下观察具有明显差异,同时随着造模时间的延长模型组心肌组织切片VEGF(血管内皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)表达情况与空白对照组比也存在显著性差异。结论 本研究结果表明与空白对照组相比连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)6 d组模型大鼠特异性心肌病所引起的心肌组织切片HE染色、VEGF(血管内皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)表达及心电图T波的变化具有显著性差异,因此大鼠连续皮下多点注射异丙肾上腺素(1 mg/kg)6 d可以作为特异性心肌病药效评价的实验动物模型使用。     

大鼠心脏胞浆胞核雌激素受体的羟磷灰石放射分析法

用羟磷灰石放射分析法分析大鼠心脏胞浆、胞核雌激素受体,表明大鼠心脏雌激素受体具有可饱和性、低容量和高亲和力、甾体特异性和稳定结合等特性;饱和分析表明雌、雄鼠心脏胞浆雌激素受体最大结合容量分别为6.91±1.08fmol/mg蛋白质和6.05±0.93fmol/mg蛋白质((?)±SD),雌鼠心脏胞核雌激素受体最大结合容量为138.3±23.8 fmol/mg DNA((?)±SD);单点分析测得雌、雄鼠心脏胞浆雌激素受体的饱和容量分别为4.25±0.72fmol/mg蛋白质(n=10)和3.98±0.87fmol/mg蛋白质(n=10)((?)±SD),雌鼠心脏胞核雌激素受体的饱和容量为113.45±2.87fmol/mg DNA(n=10)((?)±SD)。相同5份雌鼠心脏胞浆、胞核雌激素受体的最大结合容量的变异系数分别为3.69％和7.46％,表明此方法重复性好。     

SBA-15表面S-naproxen分子印迹聚合物微球的合成与分子识别特性

以手性药物左旋萘普生(S-naproxen)为模板分子,四乙烯基吡啶(4-VPy)为功能单体,采用表面印迹法,以介孔材料SBA-15为载体合成了能选择性识别S-naproxen的分子印迹聚合物微球.扫描电镜及孔结构分析结果表明,所合成的分子印迹聚合物微球具有粒径均匀、孔径分布窄、比表面积大等特点;同时扫描电镜、X射线衍射和红外光谱分析结果表明载体表面形成了分子印迹聚合物层,Scatchard分析表明分子印迹聚合物在自组装过程中存在两类结合位点,聚合物高亲和力和低亲和力结合位点的最大表观结合容量分别为Qmax1=2.504μmol/g,Qmax2=16.680μtmol/g;分子印迹聚合物的热力学研究表明,吸附过程可以自发进行.     

双季铵盐表面活性剂的合成及表面活性研究

用脂肪酸制备了乙撑双(二甲基)季铵盐基双脂肪酸甲酯(B)及乙撑双(二甲基)季铵盐基双脂肪酸钠盐(C),用红外光谱对其结构进行了表征.经测定,分别用十二酸和十四酸制备的B1和B2其临界胶束浓度(cmc)分别为1.4×10-4和2.2×10-4 mol/L,其表面张力(γcmc)分别为30.5和37.8 mN/m;C1和C2的cmc分别为7.8×10-5和3.0×10-4 mol/L,γcmc分别为28.9和36.9 mN/m.结果表明,与普通表面活性剂相比,双子表面活性剂B1和B2的cmc要低1～2个数量级,γcmc也低了2～9个mN/m;C1、C2的cmc仅为普通表面活性剂的1/60～1/230,而γcmc相差不大.     

Exendin-4高活性短肽模拟物的筛选及生物活性

以细胞表面胰高血糖素样肽(GLP-1)受体为靶标,利用噬菌体筛选技术,通过Exendin-4竞争性洗脱筛选GLP-1受体激动剂,得到了12肽模拟物EPA.细胞增殖实验结果表明:EPA和Exendin-4均可促进胰岛β细胞增殖活性,在40～200μmol/L内,EPA比Exendin-4的活性高5%～25%;在100mmol/L高浓度葡萄糖毒性下,EPA通过抑制bax基因和上调bcl-2基因表达及抑制Caspase-3活性来抑制胰岛β细胞的凋亡;EPA是具有高活性的Exendin-4短肽模拟物,可通过bcl-2/bax…Caspase-3信号通路抑制线粒体的凋亡.     

氯嘧磺隆分子印迹聚合物的合成及其性能

建立了微球形氯嘧磺隆分子印迹聚合物的合成方法.优化了影响聚合物吸附性能的参数,对聚合物微球进行了性能表征.在氯嘧磺隆印迹微球的合成方法中,功能单体为甲基丙烯酸,交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯,溶剂为乙腈,引发剂为偶氮二异丁腈,当其用量分别为0.25,1.5,5 mmol(物质的量比1:6:20)、30 mL和0.30 mmol时合成的分子印迹聚合物对氯嘧磺隆有最好的特异性吸附能力.运用Scatchard 方程测定了该聚合物的结合能力.结果表明,聚合物中具有两类亲和性吸附位点,高亲和性吸附位点的最大表现吸附量Qmax1为63.46 μmol/g,平衡常数Kd1为0.655 7 mmol/L;低亲和力吸附位点的最大表观吸附量Qmax2为437.085 μmol/g,平衡常数Kd2为11.00 mmol/L.聚合物微球在重复使用9次后吸附性能基本无下降.本制备方法具有无需研磨筛分即可得到分子印迹微球的特点,便于作为固相萃取柱和色谱柱的填料使用.     

异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的肾小球系膜细胞活性的影响

目的探讨异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的人肾小球系膜细胞HRMC活性的影响及相关机制.方法将体外培养的HRMC细胞分为正常对照组、高糖模型组、Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、异黄芪皂苷Ⅳ低、中、高浓度组,培养48 h.CCK-8法测定细胞增殖能力;酶联免疫吸附法测定上清液中Ⅳ型胶原含量; DCFH-DA测定活性氧含量; Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4、瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)表达.结果与高糖模型组比较,随着异黄芪皂苷Ⅳ浓度的增加,给药组的HRMC增殖水平依次降低,差异具有统计学意义(P0.05),Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组的HRMC增殖水平明显低于高糖模型组,差异具有统计学意义(P0.05);与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的Ⅳ型胶原含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05),其中,异黄芪皂苷Ⅳ呈剂量依赖性降低HRMC上清液中Ⅳ型胶原表达;与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的细胞活性氧含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05),其中,异黄芪皂苷Ⅳ呈剂量依赖性降低细胞活性氧含量;与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表达水平均明显下降,TRPC6蛋白表达水平明显上升,差异具有统计学意义(P0.05).结论异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的HRMC损伤具有保护作用,其机制与抑制细胞增殖、降低活性氧生成、下调TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表达、上调TRPC6表达有关.     

三唑醇分子烙印聚合物的吸附特性

实验采用分子烙印技术合成了对农药三唑醇有特异性作用的分子烙印聚合物(molecularly im-printed polymer,MIP).通过平衡吸附实验,评价了其对三唑醇的亲和力和选择性.与非烙印聚合物相比,分子烙印聚合物对三唑醇表现了较强的亲和力;Scatchard分析表明,以甲基丙烯酸为功能单体,以三唑醇为模板的分子烙印聚合物,通过离子作用和氢键作用可形成两类结合位点.用多点结合模型计算两类不同结合位点的离解常数为Kd1=2.80×10-4mol/L,Kd2=9.71×10-3 mol/L.实验表明,该聚合物对三唑醇有高亲和力和选择性,为在生物样品中选择富集三唑醇提供了可能性.     

FGF21改善STZ诱导的1型糖尿病小鼠心肌纤维化的实验研究

目的探讨FGF21对STZ诱导的1型糖尿病小鼠心肌纤维化的影响。方法 32只8周龄雄性C57/BL6J小鼠随机分为对照组(n=6),FGF21siRNA对照组(n=6),1型糖尿病组(n=10),1型糖尿病+FGF21siRNA组(n=10)。以150 mg/kg体质量的剂量单次腹腔注射STZ建立1型糖尿病小鼠模型,造模后行FGF21siRNA给药。实验到达终点时,光镜下观察Masson染色心肌组织,电镜下观察纤维化程度,利用real-time PCR技术检测心肌组织Ⅰ型(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、TGF-β及FGF21mRNA的表达含量。结果与正常组小鼠相比,STZ诱导的1型糖尿病小鼠心肌细胞胶原纤维增生,伴随小鼠心肌组织ColⅠmRNA、ColⅢmRNA、TGF-βmRNA、FGF21mRNA表达增加,经FGF21siRNA处理后FGF21mRNA减低,心肌细胞胶原纤维增生更明显,心肌组织ColⅠmRNA、ColⅢmRNA、TGF-βmRNA的表达进一步增加。结论 FGF21可改善STZ诱导的1型糖尿病小鼠心肌纤维化。     

西帕依固龈液对IL-1β刺激人牙龈成纤维细胞产生PGE2的影响

 研究不同浓度西帕依固龈液对白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)刺激人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblast,HGF)产生前列腺素E₂(Prostaglandin E₂,PGE₂)水平的影响。采用健康人牙龈组织原代培养的HGF细胞,以1ng/mL的IL-1β作为刺激因子,将HGF细胞按5×10⁴/mL的细胞密度接种到24孔培养板中,每孔200μL的细胞悬液。孵育24h贴壁后,弃原培养液,清洗2次后加药,分组为空白对照组(用含20mL/L的胎牛血清的DMEM培养液),IL-1β组(浓度为1ng/mL),IL-1β+西帕依固龈液组(西帕依固龈液终末浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL),IL-1β+消炎痛(消炎痛浓度为100ng/mL)。用酶联免疫法测定PGE₂含量,观察不同浓度的西帕依固龈液(分别为12.5、25、50、100、200μg/mL)对HGF培养上清中PGE₂水平的影响。结果显示,5种不同浓度的西帕依固龈液均能显著抑制1ng/mL的IL-1β刺激后HGF产生PGE₂,随着浓度的增加,抑制效果也增加,但5种浓度的西帕依固龈液抑制效果均低于100ng/mL的消炎痛。由此得出,HGF具有合成和分泌PGE₂的功能,IL-1β能有效刺激HGF产生PGE₂;西帕依固龈液对IL-1β刺激HGF合成和分泌PGE₂具有显著抑制作用,其抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性。