大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。     

真核生物多顺反子表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin插入含有FHIT(抗肿瘤人脆性组氨酸三联体基因)和EGFP的pIRES2-FHIT-EGFP载体中构建了真核多顺反子表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP,用脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.经RT-PCR、RT-PCR southern blot、northern blot和免疫细胞化学分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察和免疫细胞化学分析结果显示Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达,为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的表达、纯化及活性分析

将大肠杆菌二硫键异构酶DsbC基因克隆到表达载体pRSETc中,并在宿主菌E.coli BL21(DE3)中通过IPTG诱导进行可溶性表达.用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了His6-DsbC,通过Superdex 75凝胶过滤层析获得纯His6-DsbC蛋白.Western blot和凝胶过滤层析分析表明,该蛋白以二聚体的形式存在.通过RP-HPLC分析,表达的His6-DsbC以氧化型和还原型存在,并且该两种形态在一定的氧化还原体系中能够相互转化.HRP重折叠实验说明,重组DsbC能够提高HRP的复性率.     

HBs和HCVc基因双顺反子质粒在BALB/c小鼠体内的分布

 采用注射含双顺反子质粒后,PCR法扩增不同组织中HBsAg和HCVc基因,同时检测HBV和HCV抗体应答水平.研究注射基因免疫用双顺反子质粒在小鼠组织中的分布.pcDNA3.0BApc154S₂S 1次注射BALB/c小鼠后,24 h内主要分布于血液、肝、脾、骨髓、淋巴结、注射部位肌肉、肺和肾等含血液丰富的组织中.注射后2 d主要在骨髓、血液和注射部位肌肉中存在.7 d后仅在注射部位肌肉中能检测出来,并可持续到第9周.组织切片镜检质粒注射初期肌肉细胞轻度浊肿,随后肌膜细胞轻度增生,未见其它明显的组织病理学变化.质粒多次免疫BALB/c小鼠未见明显的临床症状和病理组织学变化.质粒在小鼠体内不同组织存在时间不一致.     

D-甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及催化条件的研究

根据已知的放射性土壤杆菌体内的D-甘露糖异构酶（Fmi）氨基酸序列,设计适合在大肠杆菌内表达的Fmi基因序列（1245bp）,采用体外基因拼接合成。构建了表达Fmi的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30-Fmi,诱导表达的Fmi蛋白经SDS-PAGE验证为可溶性蛋白,分子量44000。通过实验优化了Fmi的催化条件,结果表明Fmi催化的最适pH值为7.5,最适温度为45℃,催化1h酶活达5.29U/mL。以25%的果糖溶液为底物时,催化2h果糖转化率达29.4%。     

大肠杆菌系列融合表达载体的构建

许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和TF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP-hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60%,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择.     

人肝细胞再生增强因子双顺反子表达载体的构建及表达

PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体pAIE.另外体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblast cells,sFFCs),脂质体lipofectAMINETM介导pAIE转染sFFCs,经过筛选后形成单克隆细胞,RT-PCR和免疫组化方法进一步检测ALR基因的表达.进一步将转基因细胞饥饿培养,体外成熟培养绵羊卵母细胞146个,进行体细胞核移植,经融合、激活后,在培养液中进行发育培养,对发育到8细胞胚胎在激光共聚焦显微镜下观察;同时利用免疫组化检测ALR基因在胚胎中的表达.结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因在sFFCs内同时存在并表达;得到45个8细胞体细胞克隆胚胎,其中14个发育形成囊胚,EGFP和ALR基因在体细胞克隆胚胎中同时存在并表达.因此由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可减少检测目的基因的繁琐手段,可得到高纯度表达ALR基因的转基因细胞和胚胎,为生产药用蛋白治疗肝脏疾病奠定实验基础.     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

显著提高大肠杆菌中外源基因表达产物可溶性的双顺反子表达载体pNJUTRX-1

ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｈａｓｂｅｃｏｍｅａｓｔａｎｄａｒｄｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ .Ｅ .ｃｏｌｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｈａｖｅｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｅｃｏ ｎｏｍｉｃｓａｎｄｌｏｇｉｓｔｉｃｓ .ＴｈｅｓｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｈａｖｅｍａｄｅＥ .ｃｏｌｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｐｏｐｕｌａｒｃｈｏｉｃｅｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ…     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

异戊二烯焦磷酸异构酶的表达及其催化功能验证

以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,采用聚合酶链式反应扩增法分别克隆来自大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因,将其在大肠杆菌BL21(DE3)中异源过量表达,验证其催化功能,并考察其对β-胡萝卜素和异戊二烯合成的影响。结果表明,来自枯草芽孢杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶对β-胡萝卜素和异戊二烯的产量有明显的促进作用,该酶的异源表达使β-胡萝卜素的产量由1.08mg/L提高到3.25mg/L,异戊二烯的产量由0.80mg/L提高到2.96mg/L。     

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

在拓扑异构酶Ⅰ缺失的大肠杆菌中拓扑异构酶Ⅲ参与高负超螺旋的消除

在拓扑异构酶Ⅰ缺失的大肠杆菌突变株中,抑制转录和翻译可以消除高度负超螺旋.为了检测起作用的拓扑异构酶,在拓扑异构酶Ⅰ缺陷的菌株中,以萘啶酮酸抑制旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的活性,结果表明并未影响高度负超螺旋的消除.进一步作了拓扑异构酶Ⅰ,旋转酶,拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ的体外松弛实验,结果表明,拓扑异构酶Ⅱ可以松弛高度负超螺旋到正常的超螺旋水平.可以认为拓扑异构酶Ⅱ负责松弛高度负超螺旋并受到某种信号机制的调控.     

葡萄糖异构酶的双层固定化及其在高果糖浆工业化生产中的应用

在对多孔三甲铵甲基聚苯乙烯(TMPS)载体的合成研究基础上，运用分子沉积技术，完成葡萄糖异构酶(GI)200ks双层固定化试验，并在万吨生产线上进行1700t果葡糖浆生产试验。结果表明，开发的双层固定化葡萄糖异构酶(IGI)活力可达到2200μmol/min·g于胶，活力回收率达68．5%。载体机械强度良好，双层IGI的活力比单层IGI活力提高114%，IGI的半衰期45d左右，3个半衰期的转化力为11840kg干基葡萄糖/kgIGI。这一结果与普通IGI相比，相同高果糖浆生产能力的异构化装置可缩小1倍，载体用量可减少1倍。     

构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.     

新型双抗虫基因植物表达载体的构建及其在转基因烟草中的表达

用一个合成的编码完全活化的苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry1Ac的嵌合蛋白基因BtS29K与慈菇蛋白酶抑制剂A和B的融合蛋白基因API-BA构建了双抗虫基因植物表达载体pBS29K-BA.通过农杆菌介导法将该双抗虫基因转入烟草,获得了一批可同时表达两个抗虫蛋白的转基因植株.Western blot分析结果表明Cry1Ac和API-BA蛋白的表达量分别达到3.2μg/g鲜叶重和4.9μg/g鲜叶重.用棉铃虫进行的杀虫试验表明,在中～高抗虫(70%以上的昆虫死亡率)植株中,表达双抗虫基因的植株百分数较仅表达Bt基因的高10%,比仅表达API-BA的高25%.证明用完全活化的Bt蛋白编码序列与蛋白酶抑制剂基因构建双抗虫基因表达载体可以确保两个基因抗虫功能的充分发挥.     

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性.天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长.笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因（天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因）构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础.     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.