山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β－酪蛋白基因启动区５′端上游调控序列和外显子１,２及内含子１在内的乳腺表达载体,并与人血清白蛋白（ｈＡＬＢ）小基因（含全长ｃＤＮＡ序列及其内含子１）构建成融合基因,鼠尾静脉注射实验表明,该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达,应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵,并将受精卵移植于假孕母鼠,共获得３３只Ｆ０代小鼠,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,有８只小鼠基因组中整合有ｈＡＬ     

小鼠乳清酸蛋白启动区指导人促红细胞生成素在转基因小鼠乳腺的表达

以小鼠乳清酸蛋白基因（ｍＷＡＰ）调控区与人促红细胞生成素基因（ｈＥＰＯ）构建晤基因,经动物个体暂态表达方法确证ｈＥＰＯ可在乳特异表达后,用显微注射方法将融合基因导入小鼠受精卵,再将受精移植到假孕小鼠,获得８６只Ｇ０代小鼠,经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有５８只整合阳性小鼠,整合率为６７％,ＥＬＩＳＡｋｉｔ,ｄｏｔＥＬＩＳＡ等方法检测小鼠３９只,有１６只表达阳性,     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

核定位蛋白基因在转基因小鼠制备中的应用

采用细胞质共注射方法,将目的基因表达构件中α-sl-casein-hG-CSFt和哺乳类核定位基因表达构件导入受精卵细胞质,利用核定位蛋白的定向迁移功能,将目的基因表达构件带入原核,获得转基因小鼠。这种转基因途径不仅可以提高转基因小鼠的出生率,而且整合率达58％（29／50）,表达率达75％,用Western blotting方法初步估算表达水平在60－550mg/L乳清。因此这种转基因方法可以替代受精卵原核注射的转基因方法,且效率高、方法简单、实用、便于推广。     

核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员, 对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用. 在通过显微注射法获得携有hb1f转基因的Founder小鼠后, 各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交, 同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系. 经F1, F2以及测交子代的分子鉴定, 已成功完成了hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立, 同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员,对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用.在通过显微注射法获得携有hblf转基因的Founder小鼠后,各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交,同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系.经F1,F2以及测交子代的分子鉴定,已成功完成了hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立,同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究

通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子Ⅸ的表达载体ｐＭＣⅨｍＤＮＡ导入５８６枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的４９９枚受精精卵移植于假孕受体母鼠,获得２１６只Ｆ０代仔鼠。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂产分析证实有６只仔鼠的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为３％;ＥＬＩＳＡ测定２只Ｆ０代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子Ⅸ蛋白的含是均已达１００ｎｇ／ｍｌ一期法测定其     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员, 对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用. 在通过显微注射法获得携有hb1f转基因的Founder小鼠后, 各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交, 同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系. 经F1, F2以及测交子代的分子鉴定, 已成功完成了hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立, 同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

小鼠精子发生后期生精细胞的基因表达谱

在精子发生后期由圆形精子细胞分化为成熟精子的过程称为精子形成（spermiogenesis)，为探索参与精子细胞变态的相关基因，利用cDNA微阵列技术研究了Balb/c小鼠精母细胞，圆形精子细胞及长形精子细胞的1176个已知基因的表达谱，结果表明在这3种生精细胞中，共检测到208个基因的表达，其中大多数基因从精母细胞到圆形精子和长形精子表现为表达下调，但有7个基因在圆形精子细胞中表达上调，3个基因在长形精子细胞中表达上调，从以上差异表达的基因中选取了7个基因，利用半定量RT-PCR方法对微阵列的结果进行了验证，发现其中的6个基因在不同生精细胞中的差异表达与微阵列结果一致，1个基因未显示出差异表达，这些结果为研究精子形成相关基因的表达。调节以及功能提供了重要的线索。     

利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

用玻璃针将Effectene^TM包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定, 有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架, 整合率为4%(2/41). 通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达, 表达量为4.6 ng/mL. 实验证明, 精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径, 为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.     

昆明种犀牛小鼠及其分子遗传基础

无毛型(hr)和犀牛型(hr^rh)小鼠是无毛基因(hr)突变时的两种不同表型, 但犀牛小鼠与丘疹性秃头症患者有着更相似的病理特征, 因而是重要的实验动物模型. 报道了中国科学院昆明动物研究所饲养的昆明小鼠封闭群中发现的犀牛型无毛小鼠, 并将其命名为犀牛小鼠KIZ. 从形态学、皮肤组织病理学、基因序列分析、家系分析和基因功能分析等方面进行了系统的研究, 证明无毛基因(hr)第2817位的无义突变(C→T)是导致犀牛小鼠KIZ的原因. 在昆明小鼠中发现的犀牛型无毛突变小鼠, 由于其遗传机制清楚, 将是一个很有前景的实验动物模型.     

2-细胞小鼠胚胎电融合后的体外发育

细胞融合是研究细胞调节机理和多倍体对发育作用的技术。研究多倍体胚胎常用的手段是采用灭活的仙苔病毒(ISV)融合法、聚乙二醇(PEG)诱导融合法、细胞松弛素B(CB)介导法和电融合(EF)法。国外学者采用这4种方法均获得小鼠、大鼠和兔融合胚胎,分别研究了融合胚胎在体内或体外的发育。目前国内对小鼠多倍体胚胎研究的报道很少。黄少华等报道的小鼠电融合胚胎在体外培养时分裂率很低,未能从核型证明融合胚胎为四倍体,因为只有个别分裂胚胎在体外发育到8-细胞阶段。本实验采用电融合法研究2-细胞小鼠胚胎融合后的体外分裂及发育,并利用细胞遗传学方法分析融合后胚胎体外发育而成的附植前胚胎的染色体分裂相和分裂球数目,证明胚胎的多倍性及分裂率;通过与正常1-细胞和2-细胞小鼠胚胎体外发育结果进行比较,揭示电融合胚胎在体外分裂与发育的规律,为进一步研究多倍体胚胎发育机制提供参考。     

不同类型核受体对小鼠体细胞重构胚胎发育能力的影响

为探讨昆明白小鼠不同类型的卵胞质对小鼠体细胞核移植胚胎发育的影响, 采用C57BL/6小鼠耳成纤维细胞为核供体, 昆明白小鼠卵母细胞为核受体进行单次核移植, 同时采用将重构胚类合子核移入去核合子、重构胚2-细胞卵裂球细胞核移入去核MⅡ期卵的方法进行连续核移植, 通过将重构胚2-细胞卵裂球与正常昆明白小鼠2-细胞胚胎卵裂球交换融合得到四倍体胚胎. 对所得胚胎进行体外培养, 结果发现, 以去核的昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为核受体进行单次核移植所得到的重构胚胎发育率很低, 且只能发育到8-细胞阶段. 两种连续核移植重构胚发育率均有所提高, 但仅重构胚类合子核移入去核合子时有囊胚出现, 囊胚发育率为1.9%. 重构四倍体胚胎囊胚发育率却很高(62.3%), 染色体分析表明其中51.5%为真正的四倍体. 结果表明, 昆明白小鼠不同类型核受体对重构胚胎的发育能力有显著影响, 其去核卵母细胞胞质对体细胞核重编程的能力较弱, 而当其与正常受精卵胞质共同作用时可较好地对体细胞核重编程.     

基于BAC同源重组高效构建小鼠胚胎干细胞Nanog基因报告体系

Nanog是最新发现的一个在胚胎干细胞(ES细胞)中特异表达, 并在保持ES细胞多能性的机制中有重要作用的转录因子. Nanog基因的表达能非常灵敏地随ES细胞的分化而下调, 使之成为指示ES细胞多能性最理想的标志基因之一. 本研究基于细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)同源重组技术, 并改进了将报告基因敲入目的位点的重组方案, 高效构建了小鼠ES细胞(mES细胞)的Nanog/EGFP报告体系. 基因打靶后的mES细胞具有与其源mES细胞相同的特性, 并能稳定地将Nanog与EGFP (enhanced green fluorescence protein)的表达偶联. 此报告体系能通过EGFP的表达有效报告Nanog基因的表达水平, 从而对mES细胞分化或未分化状态作出明显指示. 本研究为mES细胞自我更新和分化的研究提供了一个理想的实验体系, 不仅能用于进一步优化mES细胞的培养体系, 对研究Nanog的表达调控及其与其他维持mES细胞多能性的因子和途径之间的关系也有深远的意义.