脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

血清浓度对MDCK细胞低密度培养的影响研究

目的:确定血清浓度对犬肾细胞(MDCK)培养的影响.方法:在DMEM培养基中添加了2%、5%、8%、10%的新生牛血清,以10个/cm2密度接种MDCK细胞培养后通过细胞集落计数,计算贴壁率.结果:不同血清浓度培养MDCK细胞均能形成明显的细胞集落,贴壁率分别为23.15%、43.17%、61.00%、74.89%.结论:血清浓度对MDCK细胞集落的形成及细胞贴壁率有明显的影响,8%和10%血清的贴壁率较高,适合该细胞培养.     

草鱼生长激素基因在COS7细胞中转染表达的研究

应用RT-PCR技术克隆草鱼生长激素(gcGH)的cDNA,将此cDNA定向插入真核表达载体VR1020中,构建成重组真核表达质粒VgcGH.利用脂质体法使质粒VgcGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实gcGH基因在COS7细胞中得到了持续和正确的转染表达.     

MDCK单克隆细胞生长特性分析

目的:分析MDCK(犬肾细胞,Madin-Darby canine kidney cells,MDCK)单克隆细胞的生长特性,确定MDCK单克隆细胞库的可用性。方法:通过台盼蓝拒染测定细胞复苏活率,依据细胞生长的快慢、好坏和观察细胞形态判定细胞的生长速度、状态和形态.结果:MDCK单克隆细胞平均复苏活率为0.954±0.016,2～3 d长满的细胞占92.1%.57.9%的细胞生长状态良好,具有多角上皮样、梭形成纤维样和圆形岛状样三种形态.结论:MDCK单克隆细胞库中细胞复苏活率达到0.954±0.016,92.1%的单克隆细胞株在2～3 d长至单层致密,细胞状态良好.库内细胞有三种形态,可为病毒敏感细胞基质筛选提供丰富的资源。     

流式细胞术在高等植物细胞学研究中的应用

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析技术,目前已广泛应用于细胞生物学、发育生物学、细胞动力学、分子生物学等植物学研究的多个领域。本文简要论述了流式细胞仪的工作原理,并对其在高等植物细胞学研究中的应用做了综述。     

RNAiFect~(TM)和SuperFect转染试剂对4种细胞活性的影响

在RNA干涉中,转染试剂的用量与siRNAs的量成正相关关系,但因转染试剂对细胞有一定的毒性作用,超过一定用量可以引起细胞形状改变、脱落、甚至死亡,直接影响着干涉的效率,所以确定转染试剂的优化用量,是RNA干涉试验中的重要环节.将不同用量的RNA iFectTM和SuperFect两种转染试剂分别加入鸡胚成纤维(CEF)细胞、293细胞、PK细胞和MDCK细胞中,在4h和24h后观察细胞的活力情况,比较了不同转染试剂对不同细胞的影响.结果表明:相同用量的两种转染试剂对293细胞、PK细胞和MDCK细胞的生长的影响远远小于对CEF细胞的影响;两种转染试剂用于外源小分子转染时,建议在293细胞、PK细胞和MDCK细胞上的用量不超过3u l;两种转染试剂对CEF细胞的毒性较大,不适合用于转染.     

高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究

比较纳米材料和阳离子多聚物转染试剂携带增强绿色荧光蛋白基因对C2C12细胞和DF-1细胞的转染效率,筛选适合的基因载体。采用Entranster TM-D纳米材料和3种阳离子多聚物(Superfect、Fect、Neofect)转染试剂介导p CDH-EGFP-puro质粒分别转染C2C12细胞和DF-1细胞,24 h后用实时荧光定量核酸扩增检测系统检测转染细胞中增强绿色荧光蛋白基因的mRNA表达水平,48 h后观察并计数阳性细胞率。结果发现4种试剂分别转染的两种细胞中均有增强绿色荧光蛋白基因的表达。C2C12细胞用阳离子多聚物转染的效率略高于纳米材料转染,其中Superfect的转染效率可达到30%;DF-1细胞用纳米材料和阳离子多聚物转染的效率都高,其中Fect的转染效率达到50%。因此,阳离子多聚物Superfect用于C2C12细胞的体外转染,Fect转染试剂用于DF-1细胞的体外转染,都表现出较高效的转染效率     

大鼠血管内皮细胞siRNA转染条件的优化

目的:旨在优化siRNA转染大鼠血管内皮细胞的转染条件.方法:将0.75μL和1.5μL的脂质体LipofectamineTM3000分别与20、40、60、80nmol带荧光标记的FAMsiRNA组合,转染6、12、18、24h后,用荧光显微镜计数阳性细胞率、MTT法检测各浓度条件下内皮细胞的存活率,筛选最优转染条件.结果:(1)转染12h后,用荧光显微镜检测20、40、60、80nmol各组,均可观察到绿色荧光(2)siRNA浓度为60nmol/L,脂质体为1.5μL的组合转染效率最高,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高不明显.(3)转染时间超过24h,各组细胞荧光减弱,细胞死亡率显著增加.结论:结果表明,以1.5μL LipofectamineTM3000与60nmol/L的siRNA浓度组成转染混合物转染12h可以实现对大鼠血管内皮细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

甘蓝型油菜基因BnRCH转染人HEK293A和Hela细胞的研究

本研究从植物基因在动物细胞异源表达的角度入手,采用外源基因稳定转染的方法,向人胚胎肾细胞HEK 293A和人宫颈癌细胞Hela导入了BnRCH基因,获得了HEK 293A和Hela细胞的稳定转染子.使用RTPCR、qPCR和Western blot等方法鉴定了获得的稳定转染子,确认了稳定转染子的成功建立.本研究一方面说明BnRCH虽然为植物基因,却仍然能够在动物细胞中正常表达;另一方面也为开展对BnRCH基因在动物细胞中的功能研究和应用开发建立了平台.同时,使用免疫细胞化学法和绿色荧光蛋白质     

流式细胞术的临床应用及研究进展

流式细胞术已从最初的实验室技术发展成为临床病理学家和免疫学家用于诊断、监测肿瘤和免疫性疾病病人病情的常规工具。文章将对流式细胞术在肿瘤、免疫性疾病、细胞治疗和移植等方面的应用进展作综述。     

激光诱导动物细胞基因转移的研究

用调 Ｑ Ｎｂ：ＹＡＧ激光器输出的波长为 ３５５ ｎｍ的三倍频光进行人胃癌细胞基因转移的研究。激光束经显微镜的物镜聚焦，在样品平面上获得激光微束。钙黄素和荧光 ＩｇＧ用来模拟 ＤＮＡ分子。激光微束照射细胞，在细胞膜上打出一个可以自行恢复的小孔，同时，荧光物质通过小孔扩散到被照射的细胞内。在荧光显微镜的蓝光激发下，被照射的细胞发绿光。激光能量每个脉冲大约是 ２００ μＪ．脉冲数 １～４，脉冲宽度小于 １０ｎｓ。     

流式细胞仪在无脊椎动物细胞学研究中的应用

主要阐述了流式细胞仪在无脊椎动物血细胞分类、细胞免疫学、定量流式细胞分析、染色体核型分析、细胞核、细胞受体分析等研究中的应用,供研究无脊椎动物的科技工作者参考.     

慢病毒载体转染犬睾丸生殖细胞

摘要: 目的观察慢病毒载体( Lentiviral vector,LV) 对犬生殖细胞的转染,为基于LV 的精子介导法制备转基因动 物提供依据。方法采用睾丸打点注射法,向比格犬两侧睾丸分别注入滴度为5 × 108、1 × 108、2 × 107 TU /mL 的 慢病毒液组成3 个剂量组,每点注射量为每只犬0. 2 mL。于注射后第2 周开始采集精液,通过精液DNA 的PCR 检 测和精子荧光镜检评估绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP) 基因的整合及表达。结果1) 在高剂量组,整 合并表达GFP 基因的精子于第4 周首现并持续至第17 周; 在中、低剂量组于第5 周首现,分别持续到第14 周、12 周。2) GFP 表达的高峰期在注射后第7 周～ 10 周。3) GFP 表达于整个精子,以顶体后区和精子尾颈部表达最强。 4) 注射后第2 周～ 6 周,中剂量组犬采精困难,高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势。5) 在GFP 表达的高峰期, 绿色荧光精子的百分率在高、中、低剂量组分别为43. 33% 、35. 53% 和4. 55% ,具有明显的差异。结论基于LV 的 精子介导转基因法( Sperm-mediated gene transfer,SMGT) 可成功获得转基因犬精子,转基因阳性率、表达的强度与 持续时间与慢病毒滴度相关。     

基因导入技术及其应用

电融合和电导入技术是八十年代发展起来的一种新的生物技术。其转换率是用化学方法所得不到的。LN-101基因脉冲导入仪能提供2500伏脉冲电压和160安培电流。无论在高阻的和低阻的介质中(如盐和蔗糖缓冲剂)均能使用该仪器。     

磷酸化壳聚糖-季铵化壳聚糖载体提高体内外基因转染功效

本研究通过磷酸化壳聚糖(PC)包被季铵化壳聚糖(TMC)/质粒(pDNA)纳米复合物,制备PC/TMC/pDNA三元复合物(PTC),用于提高体内外基因转染功效.PTC粒径为100~200nm,Zeta电势为-16~-34mV,可有效缩合pDNA,保护pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA结合力,增加体外释放量.表面荷负电的PTC抗非特异性蛋白吸附能力强,经小窝蛋白介导的细胞内吞途径入胞后逃避溶酶体降解,细胞核内分布比例高.HEK293细胞体外转染试验结果显示,PTC体外转染效率是TMC/pDNA纳米复合物(TC)的1.5~3.1倍;小鼠胫前肌注射给药试验结果表明,PTC可显著提高基因体内转染效率.因此,合适质量比的PTC有望作为功能性基因药物的递送载体,用于基因治疗.     

双馈同步电机的功率流分析和效率优化

描述了双馈同步电机(DFSM)的基本方程式，提出了其定子端、转子端和电机轴之间发生机电能量转换的基本关系。重点研究了不同转差率下双馈同步电机在发电、电动和电磁制动三种工况下的稳定区域、功率流及其高效区域。试验结果表明其功率流分析和效率优化是正确的，为双馈同步电机的工程设计提供了理论依据。     

磷酸钙法转染哺乳动物非贴壁细胞

对一种哺乳动物的非贴壁细胞———ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５进行了Ｇ４１８敏感浓度以及甘油耐受性的测定；并通过磷酸钙法用含ＨＣＶＣ、Ｅ１、Ｅ２基因以及筛选标记基因———ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了转染。经Ｇ４１８筛选，获得了Ｇ４１８抗性细胞：Ｐ８１５－ＣＥ２。目前，Ｐ８１５－ＣＥ２细胞在Ｇ４１８选择压力下，已连续筛选８０余天，成功传代１２次，提示转染获得成功。实验表明：被转染细胞是否贴壁，不是决定磷酸钙法转染成功与否的决定因素；为了制备符合转染要求的合适的磷酸钙———ＤＮＡ混合物，所需各试剂的用量应该被优化。