蛋白激酶CβⅠ过表达对NRK细胞生长失调的研究

蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是多基因编码具有多功能的蛋白激酶,它在细胞的生长调节中发挥重要作用。很多研究表明,PKC不同亚类在细胞中的生理作用各有差异。为此,我们首次构建了过表达PKC βⅠ亚类的NRK细胞模型,并对此细胞模型在PKC βⅠ亚类过表达状态下的生长特性及与癌基因表达的相关性进行初步观察,以探讨PKCβⅠ亚类在细胞生长调控中的作用及其可能的作用机理。     

PKCa对人胚肺细胞增值相关基因表达及AP-1活性的影响

蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）是一类丝氨酸和苏氨酸激酶,它在细胞信号传递、生长调控和肿瘤发生中具有重要作用。PKC是一个至少由12种亚类组成的多基因家族,PKC亚类的分子异质性、不同的生化性质和细胞内定位暗示其发挥不同的生理功能,为了探讨特异PKC亚类在细胞增殖、转化中的作用,我们建立了稳定过表达PKCa的人胚肺细胞模型,分析表明过表达PKCa可以促进2BS细胞的增殖速率,并能引起细胞的部分转化特征,细胞外信号一般通过细胞核内基因表达的变化最终导致细胞表型的改变,鉴于PKCa在细胞     

蛋白激酶C的抑制剂

蛋白激酶催化将三磷酸腺苷(ATP)γ位磷酰基转移到蛋白质侧链的羟基上, 从而在将胞外信号透过质膜传送到细胞质以及通过核膜传送到细胞核信号途径中起重要的作用. 蛋白激酶C(PKC)是一大类磷脂依赖的丝/苏氨酸激酶. 目前为止至少发现12个亚基, 各个亚基有不同的组织分布和功能. 由于它们与许多疾病有不同程度的关系, 如癌症、炎症、自免疫失调、心脏病等, 因此, 一些能够封闭PKC活性及阻断细胞因子与受体结合, 或干扰信号转导通路的PKC抑制剂就有可能开发成为新药. 为此人们致力于开发特异蛋白激酶特别是亚基特异性抑制剂用于疾病治疗. PKC结构有4个保守区, 针对抑制剂作用不同保守位点, 以及运用不同的抑制机理, 人们已取得了一些成绩, 有些抑制剂已进入临床实验. 本文根据抑制剂与PKC作用位点、机理, 综述近年来PKC抑制剂的发展.     

佛波酯可能诱导心肌细胞蛋白激酶C内源性抑制物产生

曾有文献报道卵母细胞、脑等组织中存在蛋白激酶C(PKC)内源性抑制物.心肌内是否有类似物质未见报道.培养的心肌细胞经蛋白激酶C激动剂十四酰佛波乙酸酯(PMA)处理20min,细胞浆PKC活力由对照细胞的1.60±0.8nmol/min·mg分别下降到0.83±0.45(15nmol/L PMA),0.41±0.22(100nmol/L PMA)和0.11±0.02(300nmol/L PMA)nmol/min·mg,细胞膜PKC活力由对照细胞的0.23±0.02nmol/min·mg分别升高到0.57±0.19,0.72±0.09和1.19±0.07nmol/min·mg,每组心肌细胞PKC总活力没有明显差异.结果表明PMA以浓度依赖方式激活心肌细胞PKC.纯化的大鼠脑PKC的基础活力为24.4±1.     

表达钙调素反义RNA人肝癌细胞模型的建立及其对细胞增殖和转化的作用

作为Ca~(2+)在细胞内的主要受体,钙调素(Calmodulin,CaM)广泛存在于各种真核细胞中,是一种能调节细胞生长、分化和转化的多功能蛋白。 由于CaM的反义RNA相对于它的多种拮抗剂来说具有更强的特异性并且没有药理毒性作用,因此我们构建了表达钙调素反义RNA的人肝癌细胞模型,并对此模型在钙调素低表达状态下的生长特性、周期分布、基因表达及其与转化的关系进行了分析,以探讨钙调素对细胞增殖与转化的影响。     

去甲肾上腺素对不同初始表达水平α1B-肾上腺素受体表达的调节

选用α_1B-肾上腺素受体(α_1B-AR)密度分别为(6 336 913)和(773 164) fmol? mg^-1 的两株克隆HEK293 细胞, 分别用高表达和低表达α_1B-AR 表示, 比较去甲肾上腺素(NE)持续作用下不同初始表达水平的α_1B-AR 发生密度改变的差别. 结果显示10 mmol? L^-1 NE 持续作用48 h 可使高表达α_1B-AR 的密度发生下调, 却可使低表达α_1B-AR 的密度发生上调. 蛋白激酶C(PKC)抑制剂RO- 31-8220 或Calphostin C 可消除NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但对低表达α_1B-AR 的密度上调无影响. PKC 激动剂PMA 不仅可模拟NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 而且使低表达α_1B-AR 的密度也发生下调. 肌浆网/内质网钙泵抑制剂CPA 和内钙螯合剂BAPTA-AM 不影响NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但可部分抑制低表达α_1B-AR 的上调. 以上结果提示, NE 持续作用可对初始表达水平不同的α_1B-AR 密度产生不同方向的调节作用, 作用机制亦不尽相同.     

表达反义蛋白激酶Cζ亚类的人角朊细胞模型的建立及初步分析

蛋白激酶是一种多功能蛋白激酶,至少由１２种亚类所组成,每种亚类的功能互不相同。近年的研究表明,ＰＫＣζ亚类在细胞增殖的调控中起关键作用。     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC5 0 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子,它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术,成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明,EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达,而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示,EDRF2对GATA－1,NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调,提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子,与PU．1协同作用,下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。     

猪的主要组织相容性复合体表达谱分析

为了全面地了解SLA在各组织的表达情况, 深入理解SLA的功能, 利用“家猪基因组计划”中得到的大量EST, 构建了丹麦长白猪51种组织的SLA表达谱, 并进行了若干组织的不同发育阶段以及丹麦长白猪和中国二花脸猪SLA表达水平的比较. 在确定该方法可靠的同时, 发现经典的抗原呈递基因高表达于免疫组织和消化道的中段; 类似于HLA-C, SLAⅠa类基因SLA-3的表达丰度和组织表达模式明显不同于SLA-1和SLA-2. 在进行品系间比较时发现, 除空肠外, 二花脸猪的其他组织抗原呈递基因的表达水平均高于丹麦长白猪. 前者的MHC基因在多种组织(包括免疫系统、肾上腺等)的高表达可能是二花脸猪高抗逆性的基础之一, 而后者的MHC基因在空肠(上皮细胞)的高表达可能是丹麦长白猪高生长速度、高饲料回报率的一个基础.     

干旱、高盐及低温诱导的植物蛋白激酶基因

干旱、高盐和低温是严重影响作物生长发育及产量的3种不同形式的环境胁迫因子,它们都影响细胞的水分状态,使植物缺水遭受危害. 最近从模式植物拟南芥中克隆了一些同时受干旱、高盐及低温诱导的蛋白激酶编码基因,分别编码受体蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶、核糖体蛋白激酶以及转录调控蛋白激酶. 着重介绍这些环境胁迫诱导基因的表达特性以及它们的编码产物在植物对上述环境胁迫反应和信号传递中的调控作用.     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC₅₀ 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

CB促微丝解聚对cAMP-PKA信号通路的作用

细胞内第二信使双酰甘油(DG)和环腺苷酸(cAMP),在对外界信号的应答反应中起重要作用.DG激活蛋白激酶 C(PKC),cAMP激活蛋白激酶A(PKA),引起一系列靶蛋白磷酸化级联反应,调节细胞的增殖、分化和其它生理功能.我们曾发现,细胞松弛素B(CB)不仅改变微丝(MF)组装,并能刺激DG-PKC信号通路.有文献报道,在 G_0至S期早期,cAMP-PKA信号通路的激活对肝细胞的增殖具有促进作用,而这两种信号通路可能通过PKC的作用加以偶联,即PKC可通过磷酸化Gi蛋白激活cAMP-PKA信号通路.MF组装     

一个猪免疫球蛋白IgG H链基因的克隆、序列分析及表达

用RT PCR方法从猪脾脏中分离到一段 1 42 5bp的DNA片段 ,该片段编码免疫球蛋白基因 .经全序列分析证明此片段与前人报道的序列有较高同源性 ,其C区属于猪Igγ链基因亚类 3.用EcoRⅠ和NsiⅠ切点将该片段切下插入pET 3b(NSEB) ( - )中 ,表达出约 5 2ku的蛋白质 ,表达量约为 2 1 % .     

表达人类Bcl-2蛋白的L929细胞模型的建立与应用

将人类ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ以正向克隆于真核表达载体ｐＬＸＳＮ并转染于Ｌ９２９细胞,建立了稳定表达人类Ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型,利用模型细胞进行研究表明,Ｂｃｌ－２的表达对细胞的正常增殖与存活表型无明显影响,但能增加细胞对肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）两种致凋亡因素的抵抗能力。此研究丰富了ｂｃｌ－２基因调控细胞凋亡的资料,为深入探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其     

去甲肾上腺素对不同初始表达水平α1B-肾上腺素受体表达的调节

选用α１Ｂ-肾上腺素受体（α１Ｂ－ＡＲ）密度分别为（６３３６±９１３）和（７７３±１６４）ｆｍｏｌ·ｍｇ－１的两株克隆ＨＥＫ２９３细胞,分别用高表达和低表达α１Ｂ-ＡＲ表示,比较去甲肾上腺素（ＮＥ）持续作用下不同初始表达水平的α１Ｂ－ＡＲ发生密度改变的差别．结果显示： １０μｍｏｌ·Ｌ－１ＮＥ持续作用４８ｈ可使高表达以α１Ｂ－ＡＲ的密度发生下调,却可使低表达α１Ｂ－ＡＲ的密度发生上调．蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂ＲＯ－３１－８２２０或Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ　Ｃ可消除ＮＥ对高表达α１Ｂ－ＡＲ的下调作用,但对低表达α１Ｂ－ＡＲ的密度上调无影响．ＰＫＣ激动剂ＰＭＡ不仅可模拟ＮＥ对高表达α１Ｂ－ＡＲ的下调作用,而且使低表达α１Ｂ－ＡＲ的密度也发生下调．肌浆网／内质网钙泵抑制剂ＣＰＡ和内钙螯合剂ＢＡＰＴＡ－ＡＭ不影响ＮＥ对高表达α１Ｂ－ＡＲ的下调作用,但可部分抑制低表达α１Ｂ－ＡＲ的上调．以上结果提示,ＮＥ持续作用可对初始表达水平不同的α１Ｂ－ＡＲ密度产生不同方向的调节作用,作用机制亦不尽相同．     

微丝重组对DG-PKC信号通路的作用

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP_2)降解形成细胞内第二信使——三磷酸肌醇(IP_3)和双酰甘油(DG),IP_3激发胞内钙库释放Ca~2 [1],DG激活蛋白激酶C(PKC)~[2],引起一系列靶蛋白磷酸化级联反应,作为细胞内对外界信号的应答反应,调节细胞各种生理活动.我们发现G_0期C_3H_(10)T1/2/小鼠成纤维细胞经细胞松弛素B(CB)处理,促微丝(MF)解聚,可显著刺激PKC活性,显示了MF组装的改变,可能对某些信号通路具有影响.为了弄清其关系,本文就MF重组对磷脂代谢,特别是对DG-PKC信号通路的作用进行了初步研究.     

紫云英参与共生固氮的2个新结瘤素基因的分离与鉴定

通过抑制差减杂交, 比较了接种华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R的紫云英(Astragalus sinicus)的根与未接种根瘤菌的对照根在转录水平上的差异, 建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因文库, 并在此基础上证实了2个结瘤特异性基因AsⅡC259和AsG2511. 其可读框显示, AsⅡC259和AsG2511编码的多肽链长度分别为134和58个氨基酸, 其氨基端均含有一个信号肽. 结构域查询结果揭示, AsⅡC259编码的多肽链包含了2个N-糖基化位点、一个依赖于cAMP的蛋白激酶(PKA)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点. BlastP同源搜索表明, AsⅡC259多肽链仅与一个来自羽扇豆(Lupinus luteus)根瘤的新结瘤素蛋白表现出较低的同源性. 对于AsG2511多肽链, 没有发现任何明显的同源序列. Virtual Northern blot和半定量RT-PCR分析表明, AsⅡC259和 AsG2511均只在接种根中表达, 说明它们确为结瘤特异性基因; 另外, 这2个基因的表达比豆血红蛋白基因晚2~4 d, 应为晚期结瘤素基因.     

JDP2在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分化中的作用

c-Jun二聚化蛋白(JDP2)是AP-1家族成员, 参与基因的转录抑制. 为探讨JDP2在神经母细胞瘤分化过程中的作用, 构建了稳定整合有JDP2全长编码区的SH-SY5Y细胞株(SY5Y-JDP2). 实验结果显示, JDP2能促进SH-SY5Y细胞的分化. 与对照细胞相比, SY5Y-JDP2细胞在S期比例降低, 生长速率迟缓, 并且表现p21高水平表达, 在分化过程中cyclin D1降低. 由此可见, JDP2对生长的抑制作用可能是SH-SY5Y细胞撤出细胞周期进入分化的主要原因.