松材线虫分离及不同真菌对松材线虫繁殖的影响

主要对松材线虫的取样分离进行探索,并初步研究了以真菌作为食料培养松材线虫。结果表明：取样部位对分离效果有影响,蛀孔及蛹室周围分离到的线虫量明显比枝条及树干其他部位多;不同真菌培养松材线虫效果有差异,主要采用了灰葡萄孢、黄瓜镰刀菌和香蕉镰刀菌3种真菌,通过设计不同影响因素比较培养效果,发现灰葡萄孢培养效果较为稳定且最佳,其次是黄瓜镰刀菌。因此,灰葡萄孢和黄瓜镰刀菌可选用于培养松材线虫。     

木腐真菌对松材线虫病疫木处理初探

【目的】筛选在疫木中迅速定殖扩展且能抑制松材线虫生长和繁殖的木腐真菌,在抑制松材线虫生长的同时快速降解疫木的木材成分,从而实现疫木中松材线虫在被媒介昆虫传带前就被大幅减少或不能正常进入蛹室,即在侵染循环的疫木环节即被阻断的目标,为松材线虫病的有效防控提供参考。【方法】分别将2 000条松材线虫接种至培养成熟的不同木腐真菌菌落上,通过室内平板试验测定不同木腐真菌对松材线虫生长和繁殖的影响;其次,将黑松木块接种至筛选获得具有抑制松材线虫生长和繁殖作用的木腐真菌菌落上,探究其对黑松木材的降解作用。以此筛选出能明显影响松材线虫生长繁殖且具有分解木材能力的优良木腐真菌;最后将筛选获得的优良木腐真菌经大量液体培养和固体培养繁殖后接种至田间当年染松材线虫病60 cm长的伐倒松木木段上,分别于接种后的120和150 d用电钻钻孔取木样,后将木段劈开,收集天牛蛀道周围的木样,分离并统计木样内松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析木腐真菌对疫木中松材线虫种群的影响。【结果】在室内培养茯苓菌的平板上松材线虫不能成活,在黄孢原毛平革菌、B18、C11和D16菌落上松材线虫的生长和繁殖也明显受到抑制。以接种茯苓菌后木材的质量损失率最大(7.30%),其分解纤维素和半纤维素能力也最强,分解率分别为19.21% 和29.65%;分解木质素能力最强的为黄孢原毛平革菌,分解率达到31.59%。在田间接种试验中,接种同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。不同木腐真菌中,以接种茯苓后减少疫木内的松材线虫数量显著优于接种其他木腐真菌处理的。接种茯苓液体培养菌丝和固体培养菌丝150 d后,均可最大程度减少疫木内松材线虫数量,减少率分别为74.51% 和65.78%。接种茯苓液体培养菌丝后天牛蛀道的松材线虫数量较接种前减少了65.45%。【结论】茯苓在室内外分解松木和减少疫木内松材线虫两方面效果均最佳;同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。研究表明,采用不利于松材线虫生长和繁殖的木腐真菌进行松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔的应用前景。     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

细菌分离物B619与松材线虫病关系的初步研究

在无菌条件下,用从松材线虫虫体上分离到的细菌分离物Ｂ６１９、无菌线虫以及它们的混合物对无菌黑松苗进行了接种试验。结果发现,用无菌线虫或细菌分离物Ｂ６１９接种的无菌苗不发病,而把二混合后接种则使无菌苗发生萎蔫。这表明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关,二在致病性上极可能存在着协同作用关系。因此,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵梁引起的复合侵染病害。     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

松材线虫病诊断方法研究进展

松材线虫病[Bursa phelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer) Nickle) Nickle]是松树的一种毁灭性病害,也是重要的森林检疫对象。松材线虫病的诊断方法是防止松材线虫病发生、蔓延及传播的技术保证。笔者就国内外对松材线虫病树木诊断方法的研究进行了综述。     

利用愈伤组织验证细菌分离物B619与松材线虫病的关系

用细菌分离物B619、无菌松材线虫以及它们的混合物接种黑松愈伤组织,发现无菌线虫或B619单独接种的黑松愈伤组织表现为轻微褐变;二混合接种的黑松愈伤组织严重褐变、萎缩、表现高度感病;而二得混合接种的预先用抗菌素处理的愈伤组织发病较轻。这些结果与接种黑松幼苗的结果相似,再次证明了松材线虫病是一种由松材线虫和细菌共同侵染引起的复合侵染病害。在愈伤组织中单独接种B619,接种后其数量逐渐下降,而在愈伤组织中混合接种,B619繁殖很快,其数量呈上升趋势,表明在愈伤组织内松材线虫的存在有利于B619的繁殖。     

松材线虫病疫木的微波除害处理技术

采用微波技术对松材线虫病疫木板材进行除害处理并获得成功。通过对相关技术指标的测试,计算出松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner＆Buhrer）Niekle）和松褐天牛（Monochamus altermatus Hope）致死临界温度及不同厚度、湿度板材的有效处理时间。该项处理技术能够100％杀死松材线虫病疫木板材内松褐天牛和松材线虫,符合国家对松材线虫病疫木安全利用的要求。经安全性和稳定性测试,微波泄漏量低干国家标准,微波输出功率稳定,输送系统运转正常。该项处理技术高效快捷、安全可靠,对环境友好、先进适用,可用于一定厚度板材的检疫除害处理。     

松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,从马尾松林中分离获得了230株细菌,并从中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌,其中JK-JS3菌株对松材线虫的杀线活性最高.将该细菌培养滤液分别稀释2倍、4倍、10倍处理松材线虫,72h后线虫的死亡率均达到100%;线虫死亡后虫体消解,消解率分别为100%、97.8%、96.4%.测定了该细菌培养滤液对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物线虫的杀线活性,结果表明对不同种的线虫杀线活性有差异.该菌株培养滤液对松材线虫和小杆线虫(Rhabditis sp.)的杀线活性最高,其余杀线活性从高到低依次为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、腐生线虫(Panagrellus redivivus)、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫.形态特征和革兰氏染色观察,该细菌为革兰氏阳性菌、产芽孢、具有周生鞭毛;经Biolog细菌鉴定仪进一步鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

植物内生菌Bacillus spp.与松材线虫病的关系研究

松材线虫病是重要的森林病害,其致病机理还没有完全研究清楚.从马尾松健康树和松材线虫病树中分离到属于芽孢杆菌Bacillus spp.的植物内生菌,此菌及其代谢产物对断根松苗和离体松枝均有致病作用,且致病症状与松材线虫病类似,但对正常生长的松苗没有作用.这说明这种植物内生菌与松材线虫病有关,是一种弱致病菌.用1 mmol/L的苯甲酸溶液处理接种了松材线虫的松枝,松枝内的线虫照常增殖,但松材线虫病得到抑制.这说明植物内生菌是导致松材线虫病的内因,松材线虫是激发因子之一.     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。     

松幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应

研究松树幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应,表明组织褐变、失水萎蔫为病害外部症状表现标志;2月龄苗对线虫侵染的反应快速敏感,组织细胞褐变坏死反应明显。而茎已完全木质化的1 年生松幼苗和4~5年生幼树离体枝感染松材线虫后,外部症状表现为发病叶褪绿、变红褐色或褐色且萎蔫,症状首先出现在叶基部,很快向叶尖扩展,至整个针叶枯萎死亡。叶部症状的出现标志病害进入发展晚期,寄主已接近完全死亡,茎内失水和细胞褐变坏死已广泛发生。组织细胞褐变坏死反应则直接与线虫的迁移扩散、分布和数量有关。肉眼可见的皮层和髓的褐变通常发生在线虫出现之后,其褐变程度与线虫的数量呈正相关。     

苦豆草生物碱对松材线虫的抑制作用

分别用槐果碱、苦参碱、槐胺碱、苦豆碱、野靛碱、N-甲基野靛碱、莱曼碱和总碱配制成生物碱浓度为1×10-4g/mL的PDA培养基,并在培养基上接种灰葡萄孢菌后再接种松材线虫,观察、记录松材线虫繁殖的情况。结果表明,苦豆碱、野靛碱和总碱对线虫的抑制繁殖作用都较强,其中,苦豆碱能完全抑制线虫的繁殖,且能引起线虫的死亡。对测定的生物碱的分子结构及对松材线虫的活性的分析进一步验证了关于双稠哌啶类生物碱对松材线虫的活性与其分子结构中的官能团对之间关系的假说。     

松材线虫纤维素酶的活性鉴定和病理分析

分别选取了不同来源的三株松材线虫,对其可能的致病因子纤维素酶进行了基因克隆,其大小分别为1159、1138和1159 bp.随后的同源性分析结果表明这三个基因与已报道纤维素酶基因BX-eng-3具有较高的同源性,仅于含有较多重复序列处存在重复次数的差异,同时,由此获得的亲缘关系的结果与RAPD分析结果一致.对四种纤维素酶进行表达及活性确认表明四种纤维素酶水解纤维素能力相当,即纤维素酶所具有的致病性与酶活力自身无关,而是与其表达量相关,暗示存在差异的基因序列可能是纤维素酶的连接域,不影响酶的活性.选取其中一种纤维素酶BXC10进行松树纤维素水解实验,分别进行扫描电镜观察、还原糖分析和小角X射线衍射分析,结果均表明纤维素酶能有效水解松树纤维素,是重要的松材线虫病的致病因子,进一步为酶学学说提供了理论基础.     

松材线虫快速检测试剂盒研制

采用引物对K09F2/R对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条340 bp的清晰、明亮的条带.而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物.利用引物对K09F2/R构建了松材线虫检测试剂盒.采用该试剂盒可使整个检测过程不超过2.5 h;该试剂盒检测灵敏度为1/7 条线虫,达到了对幼虫成功鉴定的目的,且检测结果便于判读,检测费用较低.     

苯甲酸和苯乙酸对松材线虫及细菌活性的影响

在离体条件下，测定了苯甲酸(BA)和苯乙酸(PA)对马尾松(Pinus massoniana)水培枝叶、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)及对分离自松材线虫虫体和健康马尾松的细菌菌株GD1和GD2的作用。结果显示，BA和PA对马尾松离体松叶、松枝均具有毒性，其中BA的毒性较强；一定浓度的BA能增强松材线虫的活力，低浓度BA和较高浓度PA均能促进松材线虫的繁殖，低浓度PA能促进菌株GD1的繁殖；高浓度BA和高浓度PA均能抑制松材线虫的活力，其中BA的抑制活性较强；高浓度BA能抑制松材线虫的繁殖，高浓度BA和较高浓度PA均能抑制菌株GD1的繁殖，而BA和PA对菌株GD2繁殖的抑制活性较对菌株GD1的强。     

松材线虫病病原种群分化研究现状

探究松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus (Sleiner & Buhrer) Nickle]种内群体分化状况有助于揭示该病在我国大面积流行蔓延的机制,为进一步研究松材线虫的防控提供理论依据和技术支撑。笔者从松材线虫的形态学分化、致病性分化、遗传分化以及三者之间的相互关系等方面论述了松材线虫病病原种群分化的研究进展,并讨论了该领域今后的研究方向。