根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.     

本生烟组织培养及遗传转化体系的建立

本文研究了通过农杆菌侵染获得本生烟(Nicotiana benthamiana)转基因植株的方法。将本生烟中上部叶片消毒后切成5mm×5mm左右的小块作为外植体,在含有6-BA(3mg/L)和NAA(0.2mg/L)的MS培养基中培养2~3d,用含有表达载体的农杆菌侵染后共培养3~4d,转入含有6-BA(3mg/L)、NAA(0.2mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中培养2~3周。将外植体边缘产生的愈伤组织和芽点转移到只含有卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中继续培养,2周后分化出大量不定芽。继续培养2周,当芽长1~3cm时,将芽转移到含IBA(0.1mg/L)的MS培养基中分化生根,得到再生植株。当再生植株高8~10cm、根长4~5cm以上时,移栽到经过灭菌的营养土中。通过实时荧光PCR扩增,从获得的植株中检测35S启动子和NOS终止子外源基因片段,判定所得的植株的确为转基因植株。最后对本生烟组织培养中应该注意的问题进行了讨论。     

根癌农杆菌介导遗传转化烟草‘NC89’效率的影响因素（英文）

【目的】通过农杆菌介导将PBI121:CslA1基因转入烟草‘NC89’,研究遗传转化的影响因素,旨在提高转化效率,优化相关技术。【方法】通过培养基的筛选在MS培养基+6-BA(2.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L)获得了大量的幼苗,以其作为转基因受体材料,通过控制农杆菌浓度、预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间等条件,进行含卡那选择性培养基的筛选,获得转基因壮苗。【结果】最佳的转基因植株培养方法为:共培养2 d以后,农杆菌的浓度D600为0.7,农杆菌诱导20 min,培养基的卡那质量浓度为100 mg/m L;暗培养4 d易于提高再生率,更换选择性培养基后暗培养7 d,更容易缩短愈伤诱导的时间。用RT-PCR和Southern杂交进一步验证和分析了转基因的结果。【结论】通过优化转基因的各环节条件,实现烟草的过量表达,提高了转基因的效率。研究结果可为农杆菌介导转化法在烟草及其相关植物的遗传转化应用提供参考。     

农杆菌介导的花生抗线虫基因遗传转化体系初步研究

白皮秋花生1012种子萌发3d,获得花生无菌苗,切取子叶、胚轴、子叶柄作为外植体。用农杆菌介导法将外植体侵染20-30分钟转入培养基MS+5mg/L BA+0.5mg/L NAA+100μmol/L AS暗光共培养3d,转至加有280mg/L Cef的培养基P2或P2上诱导芽伸长,长至1-2cm时转至促根培养基MS+0.2mg/L BA+75mg/L Kan+280mg/L Cef上促根,经27天观察有5株再生苗长根。结果表明培养基P2上芽诱导率较高,长势也较好,同时乙酰丁香酮对芽诱导率起促进作用。     

根癌农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化体系的研究

采用农杆菌介导法,对骏枣愈伤组织遗传转化体系进行研究.结果表明：进行遗传转化的合适条件为：愈伤诱导培养基MS＋6-BA 0.4 mg/L＋2,4-D 1.2 mg/L;浸染之前对愈伤组织进行6d的避光培养可提高愈伤组织在共培养过程中的成活率;愈伤组织在OD600=0.4～0.6的农杆菌菌液中浸染10 min,农杆菌LBA4404的生长情况最好;在28℃黑暗条件下共培养放置16 d对转化最适宜;头孢霉素的抑菌浓度为250 mg/L;卡那霉素的筛选浓度为125 mg/L.经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到骏枣基因组中,初步实现了农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化,与以骏枣茎叶外植体建立的遗传转化体系相比,以骏枣愈伤组织为外植体共培养时间长,有利于转化.     

农杆菌介导的二氢黄酮醇3''5''羟化酶cDNA对非洲菊的转化及对其花色的影响

通过非洲菊(Gerbera hybrida)组织培养建立起适合于农杆菌介导的基因转化受体系统，非洲菊叶柄外植体在MS 3mg／L BA 0．01mg／L NAA培养基中直接诱导芽生长，在MS 0．1mg／L NAA培养基中生根培养，获得再生植株，诱导率达57％。带有云南矮牵牛(Petunia hybrida)二氢黄酮醇3’5’羟化酶cDNA的pEH表达载体与农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404融合后，与非洲菊叶柄外植体共培养3d，通过含有卡那霉素25mg/L和羧苄菁霉素500mg/L的选择培养，诱导出转基因非洲菊。经PCR和Southern分子杂交检测，证明目的基因已整合入非洲菊的基因组中，转基因非洲菊花色、花型及叶型都有显变化。     

雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究

【目的】建立雄性二倍体毛白杨再生体系,构建稳定的遗传转化方法,为进一步研究毛白杨基因功能提供试验平台。【方法】以雄性二倍体毛白杨的幼嫩茎段和叶片为外植体,1/2 MS为基本培养基,通过调整6-BA、IAA和TDZ激素浓度进行再生体系筛选;采用农杆菌EHA105介导叶盘法,控制预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和卡那霉素筛选浓度,进行遗传转化;以幼嫩叶片原生质体为受体细胞,PEG介导转化荧光标记基因EGFP,进行瞬时表达。【结果】雄性二倍体毛白杨再生过程包括继代、芽伸长和生根3个阶段,其培养基组分分别为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005 mg/L TDZ、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和1/2 MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA,该条件下生根率为96.7%,增殖系数为4.47。遗传转化过程包括预培养、农杆菌侵染、共培养、抗性筛选和生根5个阶段,其中预培养为12 h、农杆菌浓度OD₆₀₀为0.4、侵染时间为20 min、共培养时间为24 h、卡那霉素(30 mg/L)筛选45 d和抗性苗生根20 d。试验共获得86株抗性植株,其中14株分子鉴定结果为阳性。在40% PEG4000的介导下,EGFP基因瞬间转化效率为50%。【结论】雄性二倍体毛白杨再生周期短、遗传转化稳定,是杨树基础研究的理想材料。本研究拓宽了杨树遗传转化体系,为杨树分子辅助育种提供了新途径。     

桑树遗传转化技术中抗生素的浓度优化研究

调查了抗生素对根癌农杆菌介导的桑品种“新一之濑”遗传转化不同培养阶段外植体生长、分化或生根的影响及其对农杆菌的抑制效果 ,并确定 :在叶盘 (或茎尖 )转化筛选培养阶段 ,Kan (卡那霉素 )和 Cab (羧苄青霉素 )适宜浓度分别为 3 0～ 40 mg/ L和 2 0 0～40 0 mg/ L (或 6 0～ 80 mg/ L和 2 0 0～ 6 0 0 mg/ L ) ,在抗性芽继代 (或生根 )培养阶段 ,Kan和Cab分别为 40～ 5 0 mg/ L和 1 0 0～ 2 0 0 mg/ L (或 5～ 1 0 mg/ L和 5 0～ 1 0 0 mg/ L) .Cef(头孢霉素 )对桑树各种外植体的影响效果与 Cab相似 ,但两者的抑菌效果因农杆菌菌株、外植体类型以及培养阶段的不同而存在差异 ,用含 Kan、Rif(利福平 )和 Str(链霉素 )的 LB培养基浸渍叶盘则出现分化率下降、褐化死亡较严重的现象 .     

TDZ促进花生外植体分化及基因转化

以花生成熟胚的上胚轴和胚叶为外植体，通过农杆菌介导转化Bt和CpTI双基因，在共培养基和诱导培养基中加入TDZ诱导不定芽和体细胞胚，实验证明，TDZ有明显促进花生外植体分化的作用，当诱导培养基组成为TDZ0．3mg/L NAA 0.4mg/L，诱导时间为28d，分化培养基为MS时采用TDZ发胚培养基萌发的轴外植体分化率最高，可达73％，GUS基因阳性率3．5％，当诱导培养基组成的TDZ0．2mg/L NAA0.4mg/L，诱导时间为21d，分化培养基为MS时水萌发种胚叶外植体分化率最高，达56％，GUS基因阳性率2．5％。     

油菜农杆菌介导转化体系的建立

研究了抗生素浓度、菌液浓度、侵染时间以及共培养时间对转基因油菜中油821外植体分化的影响,并分别进行了分析,建立了高效的农杆菌介导的油菜遗传转化体系.实验结果表明：使用5 d苗龄的带柄子叶作为转化受体,转化率高;卡那霉素的筛选浓度对转化影响较大,最终确定11 mg/L为该实验筛选的临界浓度;侵染时间为5 min,菌液浓度OD600为0.4时,其外植体转化率最高;共培养时间为48 h时效果最好,不仅有利于外源基因的整合,也不会造成农杆菌的过度增殖;在培养基中分别加入200μmol/L乙酰丁香酮（AS）和5～10 mg/L的硝酸银,可明显提高转化率.     

农杆菌介导东方百合“西伯利亚”遗传转化体系建立

以东方百合"西伯利亚"(Lilium seberia)为材料,建立了百合再生和农杆菌介导的遗传转化体系.采用LBA4404和GV3101菌株对鳞片来源的愈伤组织进行侵染,并以鳞片作为对比转化材料,两种菌株携带有相同的双元载体pCAMBIA1301.研究结果表明,农杆菌侵染愈伤组织外植体转化率较高;乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率.另外,共培养时间、不同菌株均对转化效率有一定的影响.筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达,转化率为5%～8%.     

大豆胚芽尖再生体系的建立

以'西豆3号'等3个大豆品种为材料,以胚芽尖为外植体,研究种子萌发时间、植物生长调节剂对不定芽分化的影响以及生长调节剂对不定芽生根的影响,建立高效再生体系.结果表明种子在1/2MS培养基上萌发24 h后,将胚芽尖接种在BM+5 mg/L BA培养基上培养24 h,然后转入BM+0.4 mg/L BA+0.4 mg/L IBA培养基诱导不定芽,出芽率达64.91%～68.89%;将长3～5 cm的不定芽在BM+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L IBA培养基中培养7 d后,转入BM基本培养基中生根,生根率达22.22%～26.32%.     

生菜遗传转化受体系统的建立及鲑鱼降钙素基因的导入

以散叶生菜大速生(Lactuca sativa var.capatata L.)为试材，以MS为基本培养基。采用不同激素配比，确定生菜高效诱芽培养基为MS 0．1 mg／L6-BA 0．05mg／LNAA；抗生素敏感性试验表明，筛选培养基中适宜的卡那霉素选择压为75mg／L，抑菌剂羧苄青霉素的适宜质量浓度为300mg／L；通过根癌农杆菌介导的叶盘法将鲑鱼降钙素(sCT)基因转入大速生散叶生菜，PCR检测转化率达25．4％。     

两种遗传标记筛选物在马铃薯Desiree遗传转化应用中的研究

以马铃薯茎段为外植体,采用农杆菌介导法,将带有Bar和hpt基因的植物表达质粒载体转入马铃薯栽培品种Desiree,并对遗传转化过程中的预培养时间、抑菌素浓度、筛选物抗除草剂Basta和潮霉素的浓度等因素进行了研究.结果表明:预培养时间2 d转化效率最高;头孢霉素浓度为300 mg/L时,能够有效的抑制农杆菌的生长;以除草剂Basta为筛选物时,适宜的筛选压为0.6 mg/L,用潮霉素(Hyg)作为筛选物时,以15 mg/L为最合适;获得的转基因植株经PCR分析,证实Bar基因己经整合到马铃薯基因组DNA中,从而建立了以除草剂Basta或以潮霉素为遗传标记筛选物的马铃薯栽培品种Desiree的遗传转化体系,为利用基因工程进一步改良马铃薯品质奠定了基础.     

西瓜NPR1抗病基因的遗传转化

比较了不同预培养时间、侵染时间、共培养时间等因素对农杆菌转化西瓜的影响。西瓜遗传转化的适宜条件:3 d苗龄的子叶,预培养1 d,农杆菌侵染10~15 m in,共培养3 d;不定芽与根的潮霉素(Hyg)筛选浓度分别为20 m g.L-1和6 m g.L-1。对20株西瓜转化苗进行DNA提取,PCR检测,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。     

Agrobacterium-mediated transformation of herbicide resistance in creeping bentgrass and colonial bentgrass

Embryogenic calli were induced from the seeds of creeping bentgrass ( Agrostis palustris Huds. ) cv. Regent and colonial bentgrass ( Agrostis Tenuis Sibth. F1. Oxen. ) cv. Tiger. The embryogenic calli were precultured on fresh medium for 4-7 days and then co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens, LBA4404,which contains plasmid vector-pSBGM harboring bar coding region, synthetic green fluorescent protein (sGFP) coding region and matrix attachment region (MAR) . After 3 days of co-cultivation, the calli were washed thoroughly and transferred to MS medium containing 2 mg/L of 2, 4-D, 12-15 mg/L phosphinothricin (PPT) and 250 mg/L of cefotaxime. After 2-3 months of selection, the actively growing calli of ‘Regent‘ and ‘Ti-ger‘ were transferred to MS medium with 12-15 mg/L PPT and 250 mg/L cefotaxime for regeneration. The putative transformants were maintained on MS medium with 3 mg/L PPT for long period but control died within 1 month. After establishing in greenhouse, the transformants also showed strong resistance to 0.4 % of herbi-cide Basta but control plants died within 2 weeks. Under confocal microscope, both young leaves and roots showed significant GFP expression. PCR analysis revealed the presence of a DNA fragment of GFP gene at the expected size (380 bp) in the transformants and its absence in a randomly selected control plant.     

麻疯树根高效再生体系的建立及不定芽起源研究

为了克服现有麻疯树快繁技术的不足,分别以麻疯树胚根和子叶外植体诱导的不定根为外植体诱导不定芽.麻疯树子叶不定根诱导的最佳培养方式为:MS+5 mg/L IBA上培养4天,然后转至MS0培养基上生根.诱导生根率和生根数分别达到93.33%和6.54个/外植体.子叶不定根诱导不定芽的最佳培养基是MS+3.0 mg/L 6-BA+3 mg/L IAA,诱导率达到83.33%.麻疯树胚根的最佳不定芽诱导培养基为MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA,分化率达67.80%,平均出芽数为3.25个/外植体.对麻疯树胚根再生的各阶段进行了石蜡切片观察,明确了不定芽起源于根的薄壁细胞层.与现有技术相比,本方法具有周期短、再生效率高的特点.     

牛樟的组织培养和植株再生

以牛樟侧枝茎段为外植体,建立了牛樟高效离体再生体系,研究取材季节、消毒方式、不同激素配比等因素对茎段再生的影响。结果表明:牛樟外植体采集最佳季节为春夏两季,此时采集的外植体其污染率与褐化率均较低,且出芽快、出芽率高。依次用1 000倍甲基托布津处理10 min、75%酒精消毒30 s和0.1% HgCl₂消毒8～10 min的消毒方式能明显降低牛樟外植体的污染率,且对外植体伤害较小。MS培养基为牛樟生长最适基本培养基,牛樟外植体诱导的最佳培养基为MS + 6-BA(1.0 mg/L)+ IBA(0.1 mg/L),芽诱导率高且芽体粗壮; 丛芽增殖的最佳培养基为MS + 6-BA(1.5 mg/L)+ IBA(0.1 mg/L),丛芽增殖率高且芽体健壮; 生根培养的最佳培养基为1/2MS + ABT(0.2 mg/L)+ IBA(0.05 mg/L)+ 活性炭(0.5 g/L),30 d后生根率可达100%且根系状态较好。     

茉莉直接不定芽途径高效再生体系的建立

以茉莉的下胚轴为外植体,研究了茉莉直接不定芽器官发生途径的再生体系.结果表明:以MS为基本培养基,附加0.5 mg/L BAP和0.01 mg/LNAA的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2.适宜不定芽增殖的最佳培养体系为MS+1.0 mg/L BAP+0.1 mg/L NAA.1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/LIAA+100mg/L适于再生幼茎的生根,生根率达91%,生根后经移栽成活.     

香花槐组织培养及快速无性繁殖

以香花槐幼叶、幼茎为材料，材料经表面消毒后，接种到诱导培养基和继代培养基上，15－20天，形成愈伤组织，30－40天形成芽，50天左右，形成苗，截取无根苗到生根培养基上，15－20天后，形成根系。