黄连素通过靶向GRP78增强结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

黄连素(berberine)是从黄连中提取到的一种异喹啉类植物性生物碱,研究表明它能够显著增强肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性,但具体的作用机制并不清楚。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是内质网中重要的应激蛋白,在肿瘤微环境的刺激下通常发生过表达并且能够分泌到胞外促进肿瘤进程。研究显示黄连素能够通过抑制GRP78分泌增强5-Fu的抗肿瘤活性,纳米粒子示踪检测结果进一步表明黄连素抑制了GRP78的外泌途径。机制研究发现,黄连素能够与ATP竞争性结合GRP78,使得GRP78的ATP酶活性丧失,最终导致GRP78由活性的单体形式转变为没有活性的二聚体或多聚体形式,失去其外泌功能。这一发现表明肿瘤微环境中GRP78的存在可能是肿瘤产生耐药性的重要原因。     

黄连素通过提高活性氧水平促进HepG2细胞凋亡

本研究用SRB法、流式细胞术和荧光显微技术等方法检测分析了黄连素对人肝癌细胞株HepG-2的毒性并探究了其作用机制.结果显示,黄连素的毒性作用呈时间-剂量依赖效应,24h和48h的IC50值分别为44.10μmol·L~(-1)和8.53μmol·L~(-1);160μmol·L~(-1)时黄连素具有致死效应;当加入抗氧化剂NAC,黄莲素抑制和致死作用明显减弱.黄连素可引起HepG-2细胞凋亡,NAC作用后细胞凋亡率降低;黄连素可使胞内ROS含量持续升高;同时在黄连素作用下还降低了细胞内抗氧化剂GSH含量.表明黄连素可以通过提高细胞内ROS,耗竭胞内抗氧化剂进而诱导肝癌细胞凋亡.     

Etoposide通过线粒体路径诱导Hela细胞凋亡

目的研究Etoposide诱导Hela细胞凋亡的分子机制.方法 Etoposide处理含有10%胎牛血清DMEM培养液培养的Hela细胞;Caspase-3活性检测试剂盒检测Etoposide处理Hela细胞Caspase-3活性;激光共聚焦显微镜和Western blot技术检测细胞色素C从线粒体的释放.结果 Etoposide能够导致Hela细胞凋亡;Etoposide处理Hela细胞内的Caspase-3活性增加;Etoposide诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质.结论 Etoposide通过线粒体路径诱导Hela细胞凋亡.     

西达本胺通过线粒体凋亡途径诱导结肠癌HCT-15细胞凋亡

研究西达本胺(Chidamide)对结肠癌细胞系HCT-15的增殖抑制作用及机制. 以不同浓度西达本胺处理HCT-15细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况及细胞的药物敏感性;平板克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡;EdU实验检测细胞增殖周期;Western blot检测乙酰化组蛋白、线粒体凋亡途径相关蛋白、细胞周期相关蛋白表达水平的变化. 结果表明:西达本胺抑制HCT-15细胞增殖呈浓度和时间依赖性,细胞体外克隆形成能力减弱,凋亡增多,细胞分裂相明显减少、总周期变慢,乙酰化组蛋白H3和H4、线粒体介导的相关凋亡蛋白表达上调、p21、p27表达上调、CDK2、CyclinA2蛋白表达下调. 西达本胺可抑制HCT-15细胞增殖,通过线粒体途径诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期.     

莱菔硫烷通过线粒体诱导HepG-2细胞凋亡

探讨莱菔硫烷 (SFN)通过线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡的机制.不同剂量SFN处理体外培养的HepG-2细胞株48 h,流式细胞仪检测SFN对HepG-2细胞凋亡率影响;采用Western Blot法测定SFN对HepG-2细胞Cyt-c蛋白表达的影响;酶活性检测试剂盒测定SFN对HepG-2细胞内caspase-3和caspase-9酶活性的影响.SFN能够有效地诱导HepG-2细胞凋亡,10、20、40 μmol/L的SFN 作用于HepG-2细胞48 h后,与对照组比较凋亡率显著升高(P<0.01),并呈剂量依赖性;SFN可使HepG-2细胞胞浆中Cyt-c蛋白含量升高,与对照组比较差异显著(P<0.05);同时使细胞内caspase-3和caspase-9的活性升高,并呈一定的剂量依赖性.SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞的凋亡,可通过促进Cyt-c的释放,进而激活caspase-9,再激活下游caspase-3,最终引起细胞凋亡.     

卡托普利对高血压大鼠心肌内质网应激时GRP78和CHOP的表达及心肌细胞凋亡的影响

探讨血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利对高血压大鼠心肌内质网应激时葡萄糖调节蛋白78((glucose-regulated protein78,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达及心肌细胞凋亡的影响,用18只雄性SD大鼠随机分为Sham组(n=6),TAC组(n=6)和Cartopril组(n=6).TAC组和Cartopril组大鼠行腹主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立高血压模型,Cartopril组术前一周开始给予卡托普利灌胃.术后4周用颈动脉插管法测定各组大鼠血压值,免疫组化法检测GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达水平,TUNNEL法检测心肌细胞凋亡.结果①Cartopril组平均动脉压为(124.67±6.26) mmHg,显著低于TAC组(169.73±6.58),但高于Sham组(117.08±7.92),差异有统计学意义(P<0.05);TAC组平均动脉压高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05).②GRP78在Cartopril组的平均光密度值为0.20±0.02,显著低于TAC组(0.35±0.03),但略高于Sham组(0.16±0.03),差异有统计学意义(P<0.05);TAC组GRP78蛋白表达的平均高密度值高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05).③CHOP在Cartopril组表达的平均光密度值为0.23±0.03,显著低于TAC组(0.46±0.05),但高于Sham组(0.07±0.02),差异有统计学意义(P<0.05);TAC组CHOP蛋白表达的平均光密度值高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05).④Cartopril组可见少量凋亡心肌细胞(18.73±0.28)%,显著低于TAC组(31.67±0.54)%,但略高于Sham组(13.49±0.12)%,差异有统计学意义(P<0.05);TAC组细胞凋亡率显著高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05).说明卡托普利能够通过降低心肌组织内质网应激反应水平,对高血压心肌细胞有保护作用,其作用机制可能与其降低CHOP介导的ERS凋亡反应有关.     

肝癌细胞对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性与细胞内谷胱甘肽含量的关系

目的:比较肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对三氧化二砷(As2O3)诱导凋亡的敏感性差异,探讨细胞内谷胱甘肽(GSH)含量与其作用的关系。方法:不同浓度As2O3作用BEL-7402和SMMC-7721细胞24~96 h,流式细胞仪检测细胞DNA含量,计算细胞凋亡百分率;GSH检测试剂盒检测细胞内GSH含量。结果:0.25μmol/L As2O3作用24 h,有效地诱导BEL-7402细胞凋亡;对SMMC-7721细胞来说,需要用1.0μmol/L As2O3作用24 h才能达到相同的抑制效果。1.0μmol/LAs2O3作用72 h时,BEL-7402细胞的凋亡率为(43.8±0.2)%,SMMC-7721细胞的凋亡率为(12.8±0.2)%,检测BEL-7402细胞内GSH为(18.7±1.4)nmol/mg;SMMC-7721细胞内GSH为(50.8±5.2)nmol/mg,两者比较均有显著差异。结论:肝癌BEL-7402和SMMC-7721细胞对As2O3诱导细胞凋亡的敏感性不同,可能与细胞内GSH含量有关。     

Exfoliazone通过诱导细胞凋亡抑制HepG2细胞体外增殖

探讨Exfoliazone对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响.采用细胞培养技术,用不同浓度的药物在一定的时间内处理细胞株,应用MTT比色法检测Exfoliazone对HepG2细胞体外生长的抑制作用;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料染色,显示凋亡细胞形态;用Western-Blotting检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白的表达;Annexin V/PI双染检测Exfoliazone对HepG2细胞凋亡的影响.Exfoliazone可抑制HepG2细胞的生长,并呈现剂量和时间的抑制,在药物处理24、48和72 h后,半数细胞抑制浓度(IC50)分别为35、16 和8 μmol/L.进一步研究表明,Exfoliazone可诱导PARP切割,细胞出现核质浓集和凋亡小体等典型的凋亡形态学特征,Annexin V/PI染色证实Exfoliazone能诱导HepG2细胞凋亡,并且以早期凋亡为主.Exfoliazone可能通过诱导HepG2细胞凋亡抑制癌细胞的生长.     

虾青素通过线粒体抑制高糖诱导的HBZY-1细胞凋亡

为了探究虾青素是否能有效改善高糖诱导的HBZY-1细胞的凋亡及其抗凋亡的机制,本研究采用CCK8法测定了正常糖和高糖环境下,不同浓度的虾青素对HBZY-1细胞活力的影响,并运用相关试剂盒测试了细胞死活比例和细胞凋亡的变化,在光镜下观察了HBZY-1细胞形态的变化,使用JC-1探针在荧光显微镜下观察了HBZY-1细胞线粒体膜电位的变化,运用Western Blot技术检测了HBZY-1细胞中促细胞凋亡蛋白bax和抑制细胞凋亡蛋白bcl-2的表达水平,运用caspase 3/7活细胞荧光实时法检测了HBZY-1细胞中的caspase 3/7活性.结果表明:虾青素可有效逆转高糖引起的细胞活力降低,能抑制高糖引起的HBZY-1细胞凋亡和细胞形态异常,并能改善线粒体膜电位和影响参与调控HBZY-1细胞的凋亡相关蛋白.由此认为:虾青素可以通过影响线粒体膜电位来改善高糖引起的肾小球系膜细胞凋亡,其有可能成为改善糖尿病肾病的潜在药物.     

香豆素衍生物通过抑制细胞凋亡保护谷氨酸诱导的PC12细胞损伤

为了研究香豆素衍生物对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的影响,以谷氨酸建立体外培养PC12细胞损伤模型,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率。AO/EB双染法经荧光显微镜观察细胞凋亡形态,Annexin V/PI染色后经流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明香豆素衍生物可显著抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,在2.5-15μM/L剂量呈一定的量效关系,香豆素衍生物对谷氨酸损伤的PC12细胞具有保护作用。     

FAM105A通过caspase依赖性途径和Bcl-2家族诱导细胞凋亡

在多细胞有机体中,细胞凋亡对调节正常细胞活动和发育起着关键作用.对参与细胞凋亡的蛋白的鉴定及其机制的阐明具有重要意义.FAM 105 A是新发现的促凋亡基因,过表达会导致细胞凋亡.研究了FAM105A促进细胞凋亡的潜在机制,结果表明,在HEK293T细胞中过表达FAM105A会导致caspase-3和caspase-9的剪切/激活,同时伴随着多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase,PARP)的切割/失活.此外,过表达FAM105A能诱导细胞色素c(Cyt c)从线粒体释放到胞质,促凋亡蛋白Bax的表达水平升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降.这些结果表明FAM105A诱导的细胞凋亡过程需要caspase依赖性途径和Bcl-2家族共同参与.     

白杨素衍生物通过抑制细胞凋亡保护谷氨酸诱导的神经细胞的损伤

研究白杨素衍生物对谷氨酸诱导的神经细胞损伤的保护作用.以谷氨酸构建体外培养SH-SY5Y神经细胞损伤的模型,选择噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率;使用酶标仪,对细胞培养液中过氧化氢酶的活性和超氧化物歧化酶的活性进行检测,并对丙二醛的含量及总抗氧化能力的高低进行检测;使用Annexin V/PI的方法染色,流式细胞术对细胞凋亡率进行检测.结果:不同浓度药物(50、100、200、400μmol/L)处理可显著提高细胞存活比例,药物浓度为200μmol/L时细胞存活比例最高,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性也最高,丙二醛的含量最低,总抗氧化达到最大水平.药物浓度为100、200μmol/L,其凋亡率降低到11.39％、5.02％,较模型组的凋亡率28.06％降低了2-5倍多.白杨素衍生物对谷氨酸诱导的SH-SY5 Y神经细胞拥有效果明显的保护作用,它的作用机制或是通过抑制细胞凋亡进而达到保护作用.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合低剂量顺铂诱导多药耐药人卵巢癌细胞凋亡的实验研究

为研究卵巢癌多药耐药机制和逆转耐药,探讨在低剂量顺铂存在下,人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对多药耐药人卵巢癌细胞的杀伤增效作用及其可能存在的分子病理机制。用顺铂为诱导剂,逐步建立多药耐药人卵巢癌细胞株SKOV3/cDDP。(此细胞株经免疫组化检测P-gp高表达)。TRAIL、顺铂或两药联用12h,24h,48h,采用MTT法测试细胞毒作用,Hochest33258染色荧光显微镜下观察细胞形态学改变,透射电镜下观察亚细胞结构形态,通过流式细胞术检测细胞凋亡比例,Western blot分别检测在联用TRAIL作用前后cFLIP蛋白的表达情况。结果显示:1)单用100ng/mL TRAIL只能杀伤4.67%±0.26%的SKOV3/cDDP细胞,IC50>1000ng/mL。顺铂对SKOV3/cDDP细胞的作用存在剂量依赖性细胞毒效应,这种效应主要通过诱导细胞凋亡实现;2)亚毒性浓度TRAIL(100ng/mL)与亚毒性浓度DDP(1.0μg/mL)联用可杀死52.12%±2.84%的SKOV3/cDDP细胞。呈现出高效协同作用;3)流式细胞术分析、透射电镜观察及荧光显微镜证实其协同性杀伤作用主要通过促进诱导细胞凋亡实现;4)亚毒性浓度TRAIL(100ng/mL)与亚毒性浓度DDP(1.0μg/mL)联用,可使细胞cFLIP蛋白的表达下调,促进了细胞凋亡的发生。结论:TRAIL与亚毒性浓度顺铂联用表现出对多药耐药人卵巢癌细胞的高效杀伤作用,这种作用可能主要由促进细胞凋亡介导实现,cFLIP蛋白的表达减少可能参与这一过程。     

盐酸埃克替尼通过激活蛋白激酶C诱导Tca8113细胞表达iNOS和凋亡

体外培养Tca8113细胞,随机分为4组,(1)对照组;(2)埃克替尼处理组(20μmo1/L);(3)PKC抑制剂Ro31-8220(3μmol/L)处理组;(4)埃克替尼+Ro31-8220组(20μmo1/L Icotinib,3μmol/L Ro31-8220),不同干预因素处理细胞4h.Western blot检测不同处理组的胞膜内的PKC-α的表达水平,iNOS ELISA检测试剂盒测定细胞的iNOS含量,Griess方法测定Tca8113细胞产生的NO水平,用DNA fragmentation检测Tca8113细胞的凋亡情况.结果表明埃克替尼组DNA fragmentation细胞凋亡及上清液的iNOS,NO较对照组均明显升高;埃克替尼组细胞膜的PKC-α蛋白表达量明显增加.用埃克替尼与PKC的抑制剂Ro31-8220共同处理Tca8113细胞后,胞膜的PKC-α,iNOS的蛋白表达水平及产生的NO能被Ro31-8220显著抑制,且PKC抑制剂Ro31-8220能逆转埃克替尼引起的Tca8113细胞凋亡.埃克替尼能诱导Tca8113细胞iNOS表达和NO生成增加并能诱导Tca8113细胞凋亡;埃克替尼能促进细胞膜内的PKC-α表达增加;埃克替尼诱导的Tca8113细胞iNOS表达和凋亡与PKC有关.     

CdCl2通过破坏PML-NBs结构和促进PML降解诱导细胞凋亡

PML核体(PML-NBs)是一种相对稳定的结构,但其数目、大小和位置在细胞压力下可发生显著改变.如热休克及重金属会导致PML-NBs裂解成数目众多的小点.DNA损伤试剂,如Cisplatin和Alkylating试剂也可导致PML-NBs分散成更小的小体,甚至呈现一种弥散的状态.虽然先前的研究试图解释这些压力状态下PML-NBs的表型变化,但其机制仍知之甚少.在最近的研究中,我们用CdCl2处理Hela细胞,发现PML-NBs的稳定结构遭到破坏而弥散在整个细胞核中,有趣的是,部分PML蛋白迁徙到胞浆之中并与泛素蛋白共定位,进而引起PML蛋白的降解,最终使得PML-NBs无法恢复而诱导细胞发生凋亡.本研究为进一步认识PML和PML-NBs的功能提供了证据,也将对化学治疗药物的筛选有所帮助.     

藏药甘青铁线莲黄酮诱导肿瘤细胞凋亡及对肿瘤免疫抑制因子影响的实验研究

以甘青铁线莲黄酮提取液为研究材料,小鼠的几种肿瘤细胞为研究对象,通过CCK-8法和流式细胞术等方法,探究甘青铁线莲黄酮对肿瘤细胞增殖、细胞形态、细胞膜完整性、细胞凋亡和肿瘤细胞分泌免疫抑制因子的影响.结果显示,甘青铁线莲黄酮能够抑制S180肿瘤细胞增殖、破坏细胞膜使细胞形态发生改变、诱导其凋亡的发生和抑制分泌免疫抑制因子的分泌.结果表明,藏药甘青铁线莲黄酮通过诱导S180肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞分泌免疫抑制因子等途径,从而实现抗肿瘤的作用,该研究结果为甘青铁线莲的药理学研究提供数据参考.     

声动力疗法诱导S180肿瘤细胞凋亡中相关蛋白的转定位和表达研究

以AIF、Bid和NF-κB 3种凋亡调控相关蛋白为研究对象,应用激光共聚焦显微镜观察、免疫印迹以及PCR等方法,分析3种蛋白在超声和声动力处理后细胞内位置的改变和表达量的变化,初步探讨声动力诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路.结果显示:声动力处理后AIF由线粒体释放进入核中,介导S180细胞凋亡,但其蛋白和mRNA表达没有明显变化;NF-κB在单纯超声处理后立即活化,由胞质进入核中,同时在蛋白和mRNA水平表达上调;而Bid在各处理组未观察到活化.研究结果表明:超声和声动力诱导细胞凋亡的主要路径可能不同,超声处理后应激蛋白NF-κB立即活化,启动核信号级联反应参与调节细胞凋亡;而声动力处理损伤线粒体,释放凋亡相关蛋白,介导细胞凋亡.     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因，在153位氨基酸处引入突变，使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中，SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达，通过Ni金属螯合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白，Western blot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清知识性发生特异性反应，荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性。     

人参多糖通过抑制ROS水平和凋亡保护H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤

为探讨人参多糖缓解心肌氧化损伤的功效,利用过氧化氢(H2O2)诱导的H9c2大鼠心肌细胞建立体外心肌氧化损伤模型,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞存活率,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA),流式细胞术检测活性氧(ROS)和细胞凋亡,Western Blot法检测细胞凋亡相关蛋白.结果表明：与对照组(Con)比较,H2O2能够使细胞存活率显著下降(P<0.001);与H2O2诱导组(模型组,Mod)比较,6.25 μg/mL人参多糖预防治疗24 h将细胞存活率由(57.47±5.08)%提高到(85.65±4.28)%(P<0.001),说明人参多糖能够对抗H2O2诱导的细胞毒性作用.流式细胞术DCFH-DA染色结果显示：与Con组比较,H2O2显著升高细胞ROS水平;而人参多糖预防治疗24 h后细胞ROS水平降低,提示人参多糖能够抑制H2O2诱导的H9c2细胞活性氧水平升高,并通过降低MDA含量及提高SOD活性缓解氧化应激损伤.同时,人参多糖可通过增加H2O2诱导损伤引起的Bcl-2/Bax比值,降低凋亡相关蛋白表达来缓解氧化应激导致的细胞凋亡.总之,人参多糖通过抑制ROS水平和细胞凋亡保护心肌细胞氧化应激损伤,为阐述人参保护心脏功效机制及产品研发提供了实验依据.     

穿心莲内酯通过影响SIRT3-p53信号通路诱导鼻咽癌C666-1细胞凋亡的机制研究

在前期研究工作中发现穿心莲内酯(Andrographolide,Andro)可以抑制鼻咽癌C666-1细胞活力并诱导其凋亡,但相关的分子机制并不清楚.为了明确穿心莲内酯调控C666-1细胞活力的具体机制,本课题组在体外培养的C666-1细胞中给予穿心莲内酯处理,并通过Real-time PCR检测Sirutins家族成员(SIRT1-7)的mRNA表达进行初步筛选;通过siRNA干扰的方法沉默SIRT3之后进一步检测穿心莲内酯对C666-1细胞活力和凋亡的影响;采用Western Blotting的方法检测沉默SIRT3之后穿心莲内酯对C666-1细胞中SIRT3/p53表达的影响.结果表明:穿心莲内酯能够显著增加SIRT3的mRNA表达,而对其它亚型的影响较小;沉默SIRT3能够部分逆转穿心莲内酯对C666-1细胞活力和凋亡的影响;穿心莲内酯可通过影响SIRT3的蛋白表达调控其下游凋亡相关蛋白p53的水平进而诱导细胞凋亡.本实验为进一步研究穿心莲内酯抑制鼻咽癌的机制奠定了基础.