基于分子信标荧光增强速率检测活细胞内p21 mRNA表达

根据肿瘤抑制基因p21序列设计合成分子信标,通过显微操作将其注入p21表达水平存在差异的两种鼻咽癌细胞内,以活细胞成像方式动态检测了分子信标进入鼻咽癌细胞后荧光信号的变化.p21分子信标注入两种细胞后,荧光信号均逐渐增强,约15min后达到最大值;注入细胞后4min内,细胞间荧光增强速率存在明显差异,该差异反映了p21mRNA表达水平的变化趋势,与常规逆转录PCR(RT-PCR)结果相符.在使用分子信标进行活细胞内mRNA表达水平的研究中,通过分析荧光增强速率的变化,可有效降低细胞内的酶的影响,提高检测结果的准确性.     

基于分子信标荧光增强速率检测活细胞内p21 mRNA表达

根据肿瘤抑制基因p21序列设计合成分子信标，通过显微操作将其注入p21表达水平存在差异的两种鼻咽癌细胞内，以活细胞成像方式动态检测了分子信标进入鼻咽癌细胞后荧光信号的变化．p21分子信标注入两种细胞后，荧光信号均逐渐增强，约15min后达到最大值：注入细胞后4min内，细胞间荧光增强速率存在明显差异，该差异反映了p21mRNA表达水平的变化趋势，与常规逆转录PCR（RT—PCR）结果相符．在使用分子信标进行活细胞内mRNA表达水平的研究中，通过分析荧光增强速率的变化，可有效降低细胞内的酶的影响，提高检测结果的准确性．     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC5 0 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC₅₀ 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

PKCa对人胚肺细胞增值相关基因表达及AP-1活性的影响

蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）是一类丝氨酸和苏氨酸激酶,它在细胞信号传递、生长调控和肿瘤发生中具有重要作用。PKC是一个至少由12种亚类组成的多基因家族,PKC亚类的分子异质性、不同的生化性质和细胞内定位暗示其发挥不同的生理功能,为了探讨特异PKC亚类在细胞增殖、转化中的作用,我们建立了稳定过表达PKCa的人胚肺细胞模型,分析表明过表达PKCa可以促进2BS细胞的增殖速率,并能引起细胞的部分转化特征,细胞外信号一般通过细胞核内基因表达的变化最终导致细胞表型的改变,鉴于PKCa在细胞     

硫代修饰分子信标用于活细胞内mRNA的检测

采用细胞成像的方式, 使用硫代修饰分子信标对转染GFP基因前后活细胞内靶GFP mRNA进行了实时检测. 结果表明, 硫代修饰既可保持分子信标高选择性、高灵敏度以及无需对多余探针洗脱的优点, 同时也可提高其抵御核酸酶降解的能力. 因此, 分子信标进行细胞内mRNA研究时, 硫代修饰可有效消除假阳性信号的产生, 提高检测结果的准确性.     

利用基于分子印迹聚合物膜的表面等离子体共振传感器检测TNT

利用以分子印迹聚合物(MIP)膜作为识别单元的表面等离子体共振(SPR)传感器,对2,4,6-三硝基甲苯(TNT)进行了检测.通过热引发聚合反应,在SPR传感芯片的裸金表面合成了TNT印迹聚合物膜.采用乙腈/乙酸(9:1,V/V)混合有机溶剂可以快速将TNT模板分子洗脱下来,表现为SPR共振角偏移了0.7°.吸附实验结果表明,TNT分子的最低检测限可达1×108mol/L,并且在1×108～1×105mol/L浓度范围内SPR共振角度的变化(θ)与TNT浓度的负对数(lg[TNT])成线性关系.选择性研究表明,该SPR传感器对于浓度为1×104mol/L的TNT结构类似物2,4,5-三硝基甲苯和1,3,5-三硝基-1,3,5-六氢化三嗪(RDX)没有响应.研究结果说明,结合了MIP的SPR传感器对TNT的检测具有高灵敏度、强选择性和长久稳定性的优点.     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

CB促微丝解聚对cAMP-PKA信号通路的作用

细胞内第二信使双酰甘油(DG)和环腺苷酸(cAMP),在对外界信号的应答反应中起重要作用.DG激活蛋白激酶 C(PKC),cAMP激活蛋白激酶A(PKA),引起一系列靶蛋白磷酸化级联反应,调节细胞的增殖、分化和其它生理功能.我们曾发现,细胞松弛素B(CB)不仅改变微丝(MF)组装,并能刺激DG-PKC信号通路.有文献报道,在 G_0至S期早期,cAMP-PKA信号通路的激活对肝细胞的增殖具有促进作用,而这两种信号通路可能通过PKC的作用加以偶联,即PKC可通过磷酸化Gi蛋白激活cAMP-PKA信号通路.MF组装     

微丝重组对DG-PKC信号通路的作用

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP_2)降解形成细胞内第二信使——三磷酸肌醇(IP_3)和双酰甘油(DG),IP_3激发胞内钙库释放Ca~2 [1],DG激活蛋白激酶C(PKC)~[2],引起一系列靶蛋白磷酸化级联反应,作为细胞内对外界信号的应答反应,调节细胞各种生理活动.我们发现G_0期C_3H_(10)T1/2/小鼠成纤维细胞经细胞松弛素B(CB)处理,促微丝(MF)解聚,可显著刺激PKC活性,显示了MF组装的改变,可能对某些信号通路具有影响.为了弄清其关系,本文就MF重组对磷脂代谢,特别是对DG-PKC信号通路的作用进行了初步研究.     

驱动蛋白超家族在多种疾病的发生和发展中的作用

细胞内物质运输是细胞发挥正常生物学功能的基础.驱动蛋白可作为运送细胞内物质的载体,通过与不同的骨架蛋白结合以识别不同的分子货物,从而参与这些分子货物下游的生物学效应.没有运输活性的驱动蛋白也可以通过其自身对某些分子信号通路的调节而发挥其功能.大量研究表明,驱动蛋白广泛地参与了多种疾病的发生发展过程,如神经性疾病、代谢性疾病、肾病、癌症等.本文将对近年来诸多关于驱动蛋白与疾病的研究进行综述.     

用统计物理讨论活细胞内微粒的运动

早期把活细胞内的微粒运动归为布朗运动.60年代初实验发现,活细胞内的微粒还发生时间上间歇、方向无规的跳跃运动.跳跃运动是由活细胞内ATP分子的化学能转为微粒的机械能而引起的运动,而布朗运动是由分子的热运动而引起的运动.跳跃运动是一种生命活动的形式.在细胞外无生命的微粒只能做布朗运动而不发生跳跃运动     

单颗粒等离子激元生物传感技术

贵金属纳米颗粒的表面等离子共振(SPR)效应的研究已经有近60年的历史,近年来纳米等离子激元用于生物分析传感应用取得了长足的进步.本文系统地阐述了等离子激元的形成原理与单颗粒水平分析检测技术原理,从直接传感、等离子共振能量转移(PRET)、SPR耦合、生物成像与治疗等方面概括介绍了目前利用等离子激元进行生物分析传感、生物成像与诊疗等方面的应用研究.生物传感检测技术在单分子检测、单颗粒成像与分析等领域具有重要的科学意义与应用前景.     

基于NADH荧光的组织病理生理状态多参数在体监测与评价

组织病理生理状态的实时多参数评价, 无论在动物实验研究还是临床应用中均具有重要价值, 一直是生命科学与医学研究者们广泛关注的热点. 众所周知, 临床手术过程或重症监护病房中, 患者病理生理状态的实时监测是十分必需的. 心、脑等重要组织脏器是否处于缺血缺氧等危急状态直接关系到病人的存活与否; 早期发现术中和术后次要脏器的微循环障碍有助于提高器官移植等手术的成功率和降低术后并发症的发生率. 临床常规使用的监测指标, 如血压、心电、脉搏等, 在生命指征的实时评价中发挥了重要作用. 然而, 目前的常规指标尚不足以从分子水平反映局部组织病理生理状态的早期改变. NADH是细胞线粒体中氧化还原呼吸链上的内源性关键分子, 具有自发荧光性质, 可作为一项灵敏的内源性含氧状态指标来反映机体的代谢状态和细胞活力. 本文介绍了基于NADH自发荧光信号的细胞氧化还原状态在体监测方法, 从分子水平预警机体的活力情况, 结合微循环血流、血氧饱和度等多种生理参数的同步并行监测, 不仅可在活体动物体内进行疾病的病理生理学机制研究和新药的药效评价, 还有望应用于临床外科手术和重症监护病房, 为机体活力和生命指征的实时监护提供分子水平的动态信息. 目前, NADH荧光一维信号的获取技术发展最为成熟, 可实现从离体、活细胞、活体动物乃至临床水平的实时动态监测, 已处于临床推广应用阶段. 二维动态成像也已经发展到活体动物实验阶段. 三维成像由于受制于NADH荧光的穿透能力, 只能在冷冻组织切片上实现. 如何突破因高散射所致的荧光穿透能力受限的瓶颈, 最大限度地减少环境因素对荧光信号的干扰, 在分子水平实现组织病理生理状态的实时多参数评价, 是生物医学光子学领域面临的巨大挑战.     

胞内抗体肿瘤基因治疗

自杂交瘤和单克隆抗体技术问世以来,人们一直尝试将该技术用于肿瘤治疗．抗体工程的进展使得人们能够对抗体分子进行改造,研制具有高亲和力和特异结合力的基因工程抗体．同时人们对细胞内蛋白传导信号也有了更深入了解,从而可将基因工程抗体导向不同的亚细胞区室．上述两项重要进展的结合,派生出了一项全新的可阻断细胞内重要靶蛋白的胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）技术．胞内抗体技术是指应用基因重组技术在非淋巴细胞内表达具有生物活性的抗体,并通过对抗体分子进行适当修饰,使之定向分布于细胞核、细胞…     

基于可逆加成-断裂链转移聚合的孕酮分子印迹膜制备与检测

基于可逆加成-断裂链转移(reversible addition fragmentation chain transfer,RAFT)聚合原理,通过紫外光引发方式,以2-(十二烷基硫代碳酸酯基)-2-甲基丙烯酸(DDMAT)作为唯一的控制试剂,在DDMAT修饰的金膜表面合成了针对孕酮分子的分子印迹物聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)薄膜,并作为表面等离子体共振(SPR)传感器的识别单元.通过现场原位监控MIPs薄膜生长动力学,使其厚度得到有效控制.聚合动力学研究表明,DDMAT在紫外光引发聚合过程中起到引发剂和链转移试剂双重作用.对MIPs薄膜表面进行接触角、红外光谱、扫面电子显微镜表征,结果表明通过紫外光引发的方式能够有效地将MIPs薄膜接枝到DDMAT修饰的金膜表面,且MIPs薄膜厚度均一,其表面布满的纳米尺寸孔径的孔穴,为识别孕酮分子提供了通道.在pH 7.4的PBS缓冲液中对浓度范围10~(-12)~10~(-7) mol/L的孕酮样品进行检测,结果表明该MIPs薄膜修饰的传感器对孕酮分子具有较高的灵敏度,检测限为3.24×10~(-13) mol/L(信噪比,S/N=3),且具有良好的选择识别性能和重复使用性能;稳定性实验结果显示,MIPs薄膜修饰的SPR传感器芯片在N_2气保护下,室温存储30 d对低浓度的孕酮分子样品仍具有良好的信号响应.实际水体及人工尿液中测得孕酮回收率为92.9%~96.5%,说明此传感器可用于实际样品测定.     

多功能的肽生长因子

许多肽生长因子的作用包括刺激和抑制细胞增殖二个方面,此外还有与控制细胞生长无关的效应。一种肽因子在一个细胞内可能有刺激和抑制两种活性,这依赖于其它信号分子存在的范围。     

DNA损伤修复的单分子水平研究进展

外源或内源的DNA损伤在生物体内持续发生。DNA损伤修复的缺陷与很多疾病甚至癌症等息息相关,而生物细胞进化出一系列精密的修复机制以耐受或切除这些损伤。单分子技术区别于常规的生化、分子生物学等手段,可以在体外和活细胞内研究DNA修复相关生物分子的动态反应特征,从而对DNA修复机制进行更充分的剖析。文章围绕常见的DNA损伤及其修复类型,阐述了近年来利用原子力显微镜、磁镊、光镊等单分子操控技术,以及全内反射荧光显微镜、光激活定位显微镜和超分辨显微示踪等单分子荧光成像技术在DNA修复机制研究中取得的进展,梳理了利用单分子技术解决的长期存在的关于DNA修复难题,并展望了单分子技术联合其他交叉学科技术在研究DNA修复机制方面的前景。     

基于微纳材料与器件测量细胞温度

最近10年里,科研人员研发了多种微纳尺度测温传感器,希望能够借此来精确测量细胞内的温度或温度分布,但由于单个细胞的诸多限制,这些细胞测温传感器也在不断发展完善.本文将综述近年来基于微纳材料与器件测量细胞温度的研究进展,重点介绍微纳热电偶的实时细胞测温技术,最后介绍此类传感器在药物筛选、疾病诊疗等领域中的应用,并对细胞测温技术的后续发展进行了展望.具体而言,本文指出微纳尺度的细胞测温传感器一般可以分为荧光式细胞温度测量法和探极式细胞温度测量法:荧光式细胞温度测量法主要有作为温度计的有机化合物、量子点、聚合物和生物分子;探极式细胞温度测量法主要有作为热探针的热电偶、铂电阻和碳纳米管.     

蛋白激酶Ca亚类真核表达质粒的构建和过表达细胞模型的建立及初步分析

蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是依赖于Ca~(2+)和磷脂的多功能蛋白激酶,它在细胞信号传导、生长调节、肿瘤发生中发挥重要作用.分子克隆技术表明PKC是由多基因家族编码,迄今已发现至少12种亚类,各亚类在细胞中的生理功能各有差异.为了进一步探讨特异PKC亚类在细胞生长调控中的作用,我们构建了PKCα亚类的真核表达质粒,并通过基因转染的方法导入正常人胚肺细胞(2BS),首次建立了过表达PKCα的2BS细胞模型,并对此模型进行了初步分析.