ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因K-ras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBR GreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBR GreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.     

人源IFITM2基因检测方法的建立及EMCV感染对IFITM2基因转录的影响

目的:建立一种干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,以期为IFITM2基因的动态监测提供有效的检测技术.方法:根据GenBank中公布的IFITM2基因序列设计特异性引物,以质粒pMD18-T-IFITM2为模板进行条件优化,绘制标准曲线,建立IFITM2基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行条件优化与评价,用建立的方法对脑心肌炎病毒感染后细胞中IFITM2基因转录水平进行检测.结果:建立的20μL检测体系中IFITM2基因最佳引物浓度为10μM,最佳退火温度为59℃;标准质粒在2.62×10~5～2.62×10~(10)copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好线性关系,线性方程y=-3.495 logx+43.12,R~2=0.998,且灵敏性、特异性和重复性均较高.应用建立的方法对EMCV感染细胞中IFITM2基因转录水平进行检测,结果显示,在感染早期IFITM2转录水平不变,感染后期转录水平逐渐升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基因转录水平的变化,可能与EMCV逃逸宿主相关免疫应答有关.结论:成功建立了一种快速、准确检测IFITM2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.该方法的建立,为进一步研究IFITM2在EMCV感染过程中的作用奠定了基础.     

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计井合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ作为染料建立了实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quanfitative PCR）方法．以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0．999．溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃,结果表明：本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础．     

鸭GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立鸭GAPDH基因的real-time PCR技术,为鸭功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础.根据GenBank中鸭GAPDH基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的real-time PCR方法.结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点.研究结果为鸭GAPDH作为内参基因用于鸭相关基因定量表达分析奠定了基础.     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

Multiplex chimeric primers used in a tetra-primer amplification refractory mutation system PCR to detect two single nucleotide polymorphisms associated with ovarian cancer

目的:建立一种简单快速的方法,可同时检测两个卵巢癌相关单核苷酸多态性位点rs608995和rs749292.方法:采用多重嵌合引物策略改进四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(PCR),通过设计rs608995和rs749292的特异性嵌合引物,经单管一次PCR,琼脂糖电泳分析产物长度.结果:对46份全血样本,电泳结果均与测序一致,可准确分型.结论:经多重嵌合引物策略改进的四引物扩增受阻突变体系PCR可简便、快速、准确的获得2个位点的分型结果.     

用荧光双链引物特异扩增并定量核酸

描述了一种利用特殊的双链引物－－突触引物，用于核酸扩增的特异定量检测，在传统的引物的5'端标记荧光物质，而在引物的互补序列的3'端标记荧光淬灭剂以封闭其延伸。二者杂交即成双链突触引物。在制备PCR反应混合物阶段以及加热的初期，突触引物保持稳定的双链结构而不能引导扩增，在退火阶段，突触引物部分解链导致引物延伸，荧光物质与淬灭剂分开而产生荧光。利用人β珠蛋白基因对此方法进行了验证。这种可自行退火的荧光引物不仅简单地实现了实时扩增，同时比常规的热启动PCR更有效地提高了扩增的特异性。     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

HCV基因分型与血清分型相关性的研究

目的 探讨HCV血清分型和基因分型的相关性及临床意义。方法 HCV血清学分型应用ELISA法；HCV基因分型应用型特异性PCR法。结果 1．血清学分型率为52．38％（88／168），其中血清1型阳性率为48．86％（43／88），血清2型阳性率为34．09％（30／88），血清（1＋2）混合型阳性率为17．04％（15／88）。基因分型率为54．17％（91／168），其中基因Ⅱ型阳性率51．64％（47／91），基因Ⅲ型阳性率为31．86％（29／91），基因（Ⅱ＋Ⅲ）混合型阳性率为16．48％（15／91）。结论 兰州地区HCV以血清1型即基因Ⅱ型为主，其次是血清2型即基因Ⅲ型以及血清（1＋2）型即基因（Ⅱ＋Ⅲ）型。     

"突触引物"实时荧光PCR检测端粒酶活性

为建立一种简便的端粒酶测定方法，首先采用高灵敏的核酸染料SYBR Gold染色代替放射自显影，建立了简便可靠的扩增产物显示方法，进而合成了端粒酶扩增产物的模拟产物，考察了突触引物检测的可行性和灵敏度。在此基础上，建立了检测端粒酶活性实时荧光PCR。由于突触引物可以有效的降低非特异性扩增，有效解决了端粒酶活性检测中的非特异产物干扰，为定量检测端粒酶活性打下了基础。     

基于布鲁氏菌omp25基因的环介导等温技术建立及初步应用

为了建立布鲁氏菌环介导等温技术(LAMP),并应用于基层布病诊断,本实验针对布鲁氏菌外膜蛋白基因Omp25区域设计6条引物,用SYBR Green I染料做指示剂,65℃反应60 min,85℃5 min终止,根据SYBR Green I颜色变化判定结果,用普通PCR验证LAMP检测技术的灵敏度和准确性,并对临床疑似布病病料进行检测验证其临床检测意义。结果显示:LAMP检测的灵敏度为4.2 fg/μL布鲁氏菌基因组DNA,比普通PCR高100倍左右;其特异性较好,能够准确检测布鲁氏菌,琼脂糖凝胶电泳显示阳性结果均为梯形条带,而大肠杆菌、卡介苗、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌等均为阴性;对新疆4个地区25份绵羊流产胎儿病料进行LAMP和普通PCR方法平行检测,其符合率为100%。结论:LAMP检测技术用于布病临床诊断具有快速、高效、便捷等特点,为基层布病的病原学诊断具有潜在的实用价值。     

实时荧光定量PCR的一些操作技巧

背景:实时荧光定量PCR(Qpcr)由于方法上的优势逐渐普及,受到使用者的欢迎,但是,最常用的SYBR Green I法Qpcr在使用中存在着由于不当操作而数据精度不高、重复性差、可信度的缺点。目的:向读者介绍提高SYBR Green I法Qpcr数据精度、重复性和可信度的操作技巧。方法:笔者根据实际工作中的经验详细说明一些有助于提高实验质量的操作技巧。结论:在SYBR Green I法Qpcr过程中注重操作技巧能大幅改善实验质量。     

TMEM43基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据Genbank中登录的TMEM43基因序列设计并合成引物,建立了TMEM43SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法.利用该方法构建标准曲线,并对灵敏性及重复性进行验证.最后对随机选取的几种人源细胞及不同物种细胞进行检测.结果显示,建立的TMEM43SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法线性关系好,以标准品构建的标准曲线相关系数R2=1;灵敏性比普通PCR高10倍,能成功检出不同细胞中TMEM43表达量.表明建立的TMEM43SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法可用于TMEM43基因表达的检测及定量分析,可为临床TMEM43相关疾病的检测及分析提供实验依据.     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

纤细眼虫(Euglena gracilis)核纤层蛋白基因的初步研究

目的：探讨在纤细眼虫(Euglena gracilis)中是否存在核纤层蛋白(lamin)基因，为核纤层蛋白基因的起源与进化研究提供线索．方法：以较为低等生物的核纤层蛋白基因cDNA序列为参考，设计引物P0010和P0012，以纤细眼虫总DNA为模板进行PCR，PCR产物回收、测序．由于不能获取完整序列，所以据测序结果又设计了P0013和P0014两条中间引物，组成P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR，回收产物测序．结果：P0010／P0012、P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR分别获得775、400和395bp的特异性PCR产物，对这3种产物分别测序，最终获得了P0010和P0012之间的全序列，共775bp．结论：在纤细眼虫中存在着核纤层蛋白基因．     

PCR技术研究新进展

介绍了实时定量RT-PCR的原理、方法和应用,包括SYBR Green I、AmpliSensor、Lightcycle技术和Complex探针技术;同时还对原位PCR技术的原理、方法和应用,简并PCR的原理、方法和应用作了综述。     

Apo E基因multi-ARMS与PCR-RFLP分型法的比较研究

目的：以聚合酶链反应——限制性酶切片段长度多态性（PCR-RFLP）方法作为参照，建立一种ApoE基因分型方法。方法：以基因组DNA为模板，用PCR-RFLP法和等位基因特异性复合PCR方法（Multiplex Amplification Refractory Mutation System,multi-ARMS）检测了75例个体的ApeE基因型。结果：共检测出5种常见的ApoE基因型：ε2/2,ε3/3,ε2/3,ε3/4,ε2/4。两种方法所得的结果完全一致。结论：说明multi-ARMS方法快速简便、准确可靠，具有失言应用价值。     

巢式PCR-HRM法在点突变模式小鼠基因分型中的应用

目的 利用巢式PCR结合高分辨率熔解曲线(HRM)技术，改进点突变模式小鼠的基因分型方法。方法 以ob/ob鼠和db/db鼠为样本，剪小鼠脚趾编号并提取基因组DNA。根据突变位点参考序列设计巢式PCR引物并进行两轮扩增后，对产物进行HRM分析，获得基因分型结果。同时，通过PCR-SBT法和PCR-RFLP法对分型结果的准确性进行验证。结果 对80只ob/ob鼠和65只db/db鼠进行了检测，巢式PCR-HRM法能够准确地分辨出3种基因型。在ob/ob鼠中，鉴定得到的纯合子、杂合子和野生型分别为21、47和12只。而在db/db鼠中，纯合子、杂合子和野生型分别为23、33和9只。巢式PCR-HRM法的分型结果与PCR-SBT法和PCR-RFLP法的结果高度一致，且分型结果与小鼠表型一致。结论 建立的巢式PCR-HRM法是一种快速、简便、准确度高的基因分型方案，适用于大批量点突变模式小鼠的基因分型鉴定。     

一种以测序为基础的基因分型方法的建立

设计了一种自动化的基因分型方法，能够直接利用PCR产物的DNA测序结果作为数据，通过自动化基因分型程序（automatic genotyping program)与一个含有其等位基因序列的数据库进行比较，来完成高精度的基因分型工作。用这种方法对50个随机挑选的中国南方人的HLA－DPB1基因进行了基因分型，证明该方法是可行的，并从中发现了2个不明确杂合子以及一个新的等位基因序列。随后对这些样品克隆测序，发现除了2个不明确杂合子得到了 进一步的区分外，其它样品都与前面的分型结果一致，显示了96％的精确性。通过以上的研究表明，成功建立了一种高精度的、基于序列的分型（sequence-based typing)方法。既然该方法能成功分型HLA－DPB1基因，预示了该方法同样能应用于其它基因的分型。该AGP程序可以在http:/genome.zsu.edu,cn免费下载。