人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用

用酵母双杂交系统探索P ICK 1分子中BAR结构域与PDZ结构域的相互作用.分别构建了pGAD-PDZ和pGBK-BAR重组子,共转入酵母细胞后,涂布于SD(L eu-,T rp-,H is-)固体平板培养基,经滤纸复印和显色反应,在8 h内观察到只有pGAD-PDZ/pGBK-BAR的表达产物呈阳性,而其它对照pGADT 7/pGBKT 7、pGAD-PDZ/pGBKT 7和pGADT 7/pGBK-BAR均呈阴性反应,说明BAR与PDZ结构域具有相互作用.     

转录因子E2F—1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中,转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析,目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力．     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

基于序列预测转录因子的相互作用

转录因子（TF）对真核生物的转录调控有着举足轻重的作用,而这些转录调控大多不是一个转录因子可以独立完成的,还需要其他转录因子的帮助来共同完成对基因的转录控制。我们提出了一种新的基于序列的方法来预测转录因子的相互作用,利用了转录因子结合位点（TFBS）的距离,方向和相位等信息,利用酵母菌的芯片数据来实现这一思想,获得了165对统计上有相互作用的转录因子,通过与SGD数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用的数据进行比较,可以达到约95．5％的正确率。最后我们还利用预测的结果讨论了相互作用的转录因子对在基因组上存在的一些特征,例如,他们对距离,方向,相位的倾向性。希望我们的预测有助于更好的理解真核生物的转录控制网络。     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.     

编码拟南芥含BAG结构域蛋白的原核表达载体构建

生物信息学分析显示,拟南芥基因At5g62390编码一种钙调素结合蛋白,在其钙调素结合结构域有一个BAG(Bcl-2-associated athnogene)结构域存在,与钙调素结构域部分重叠.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特征及BAG结构域在钙调素结合中可能的调节作用,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增不同结构域编码区的cDNA序列,构建到原核表达载体pET32-a中.测序分析表明:目的序列已正确克隆到表达载体上,为进一步表达目的蛋白及其不同结构域用于生化功能鉴定打下了基础.     

HARDY转录因子原核表达的研究

HARDY（HRD）是AP2／ERF—like家族转录因子,它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用率。本研究从拟南芥中克隆了HRD转录因子基因,利用DNA重组技术,构建了HRD原核表达载体PET．HRD,并将PET－HRD重组质粒转化E．coli BL21（DE3）,经1mmol／LIPTG诱导其蛋白质表达,获得了高表达量的分子量约为42kD的HRD融合蛋白。本研究结果为进一步制备HRD转录因子的抗体,并利用该抗体来分析和克隆不同物种的HRD基因奠定了基础。     

基于肿瘤蛋白-蛋白相互作用网络的药物靶标发现

基因组学的快速发展在我们面前呈现出了一幅肿瘤基因组的总构架,但目前最大的挑战之一是怎样将这些大量基因组信息转化成针对癌症病人基因变化的有效治疗方法.针对这一挑战,美国国家癌症研究所建立了癌症靶标研发(CTD2)联盟.作为国家联盟的一员,埃默里大学CTD2中心着重于对癌症基因功能的研究,建立蛋白-蛋白相互作用网络,以助发现新的癌症治疗靶点.为了实现这个目标,笔者团队通过高通量筛选技术和高通量信息学方法的共同应用,快速检测癌症相关蛋白的分子互相作用,并构建了与肿瘤相关的蛋白-蛋白相互作用网络(OncoPPi).此网络将癌症基因与相应的功能蛋白相接,并可用于发现与肿瘤缺陷有关的作用机制、新药物靶标和新的治疗方法.这些数据已存入Emory CTD2中心的portal网站,供大家分享.Emory中心是CTD2联盟一个重要组成部分,联盟内提供实时的数据分享,合作紧密.通过共同努力,笔者团队以及CTD2联盟的目标是发展新的一代肿瘤信号通路干扰药物,实现基因组学基础上的精准治疗.     

具有AP2结构域的转录因子家族的研究进展

具有AP2结构域的转录因子是一种被认为只存在于高等植物中的转录因子,但根据最新的研究发现在一些低等的生物中同样存在该转录因子。这是一种基因的入侵,具有AP2结构域的转录因子在高等植物中存在有几百个。本文综述了具有AP2结构域的转录因子的研究进展,包括三个方面:1、具有AP2结构域的转录因子是一个从低等生物到高等生物进化上的入侵基因;2、具有AP2结构域的转录因子的分子结构及功能;3、在高等植物中该转录因子的研究进展情况。此外还展望了一下这个基因家族的研究前景。     

拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

Rab蛋白家族在调控细胞囊泡的运输过程中发挥着重要作用.拟南芥中存在数量庞大的RabA亚族成员,它们参与调控植物不同阶段的生长发育过程.为了寻找拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白,进而阐明RabA在细胞活动中的角色,本研究选取RabA2b蛋白进行了深入研究.本研究首先构建过表达RabA2b的拟南芥植株,同时结合免疫共沉淀方法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测到多个Hsp70蛋白家族成员与RabA2b蛋白共沉淀.为了进一步研究Hsp70成员与RabA2b的相互关系,将5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白分别构建于植物表达载体,通过在烟草叶表皮细胞中瞬时表达Hsp70s和RabA2b发现它们共定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构.同时,体外pull-down实验证明了5个Hsp70s蛋白都能与RabA2b蛋白直接相互作用.此外,双分子荧光互补实验(BiFC)进一步证实了Hsp70s与RabA2b在烟草叶表皮细胞中的相互作用,说明拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s可以作为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白一同调控植物的生长发育过程.     

几种鱼肌肉蛋白的电泳分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对鲤鱼、草鱼、白鲫鱼、鲢鱼、罗非鱼及鲨鱼的肌肉蛋白做鉴别分析．实验采用4种不同抽提液对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白进行提取．肌肉蛋白经电泳后以银染色或考马斯亮蓝染色并对蛋白质图谱作对比分析．根据蛋白质条带的数量、迁移率及浓度等特点,得出各鱼种间的相似性及差异性．结果表明,以SDS-PAGE电泳法可实现对水产食品原料品种的初步鉴别．     

果蝇NOMPC相互作用蛋白的筛选与鉴定

NOMPC是果蝇感受触觉的机械力敏感离子通道,属于瞬时受体电位(TRP)离子通道家族,机械力敏感离子通道通过怎样的机制被机械力激活?与NOMPC相互作用的蛋白有哪些?为了研究这些问题,本研究从果蝇NOMPC全长cDNA中扩增得到其N端的29个锚蛋白重复序列(ARs),ORF长度为3 039bp.然后将这29个ARs构建到表达载体pUAST-EGFP上,转染果蝇S2细胞后,通过免疫沉淀、质谱分析和Western blot筛选和鉴定NOMPC相互作用的蛋白,实验筛选出NOMPC N端的29ARs和NOMPC全长的相互作用蛋白,通过免疫共沉淀(Co-IP)实验,对可能与NOMPC存在相互作用的蛋白质进行验证,鉴定出Annexin B9、CG3195、CG3731、CG5374与NOMPC存在相互作用,为进一步研究NOMPC介导触觉转导的分子机制提供了基础.     

ITN4-C相互作用蛋白的筛选与鉴定

我们的前期工作发现过表达RTN4-C基因能够抑制肝癌细胞株SMMC7721的生长并且促进其发生凋亡．为了进一步了解RTN4-C促进凋亡的机制，本文采用酵母双杂交的方法从小鼠7d胚胎文库中筛选其相互作用的蛋白．最终筛选到其同源家族成员RTN3．进一步采用间接免疫荧光和及构建的荧光载体表明，RTN4-C和RTN3蛋白在HEK293和Hela细胞中发生共分布．本研究为进一步阐明RTN4-C抑制细胞生长和促进细胞凋亡的机制提供了新的依据．     

拟南芥多聚ADP-核糖化修饰蛋白的富集和鉴定

多聚ADP-核糖化修饰[poly(ADP-ribosyl)ation,PARylation]是一种可逆的蛋白质翻译后修饰,该修饰由多聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]催化.多聚ADP-核糖化修饰蛋白主要在动物中发现,在植物中少有报道.微生物来源的蛋白质AF1521具有一个能结合多聚ADP-核糖[poly(ADP-ribose),PAR]的macro结构域(macro domain),其突变蛋白AF1521-G42E失去了结合PAR的活性.我们利用AF1521蛋白对PAR的亲和作用来富集拟南芥中的PARylation蛋白质底物并进行质谱分析,同时用AF1521-G42E作为富集过程的负对照.通过这种方法,我们得到多个ADP-核糖化修饰相关蛋白,并对其中一个蛋白GRP7进行了验证.     

RTN4-C相互作用蛋白的筛选与鉴定

我们的前期工作发现过表达RTN4-C基因能够抑制肝癌细胞株SMMC7721的生长并且促进其发生凋亡. 为了进一步了解RTN4-C促进凋亡的机制,本文采用酵母双杂交的方法从小鼠7 d胚胎文库中筛选其相互作用的蛋白.最终筛选到其同源家族成员RTN3.进一步采用间接免疫荧光和及构建的荧光载体表明, RTN4-C和RTN3蛋白在HEK293和Hela细胞中发生共分布. 本研究为进一步阐明RTN4-C抑制细胞生长和促进细胞凋亡的机制提供了新的依据.     

c-Mpl信号转导相关蛋白的结合域确定

血小板生成素（thrombopoietin,TPO）是调节血小板生成最主要的细胞因子，它的生物学效应由其受体c-Mpl介导，为了确定SGK，14-3-3，Siva,Toml,Cop9-S3和c-MplBP等6种蛋白在c-Mpl上的结合区域，构建c-Mpl膜内部分系列缺失片段及点突变，用酵母双杂合的方法检测这些片段与上述6种蛋白的结合情况，发现Box1是c-Mpl与这6种蛋白结合的主要区域，Box1两侧的序列及C端区域对c-Mpl与这6种蛋白的结合也有帮助，将c-Mpl膜内部分的第531位Ser(位于Box1内）突变为Ala和Val后，c-Mpl与SGK,14-3-3，Toml和Cop-S3的结合能力明显下降，提示Ser531可能对c-Mpl与这4种蛋白的结合起重要作用。     

肝核转录因子FOXA3相互作用蛋白的初步研究

FOM3基因足肝核转录因子（Hepatocyte Nuclear Factor,HNF）基因家族中含有Foxhead Box结构域的3个成员之一,在维持血糖平衡以及调控发育方面发挥着重要的作用,利用FOXA3-AD酵母双杂交载体筛选人肝cDNA-BD酵母双杂交文库,并通过共转化进行验证,获得了两个与NFOXA3相互作用的蛋白：C3和TMEM4．这些相互作用蛋白的发现为深入了解FOXA3蛋白参与糖代谢调控的分子机制提供了线索．     

基于复合物信息和亚细胞定位信息的关键蛋白质识别

针对蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络中存在大量噪声,以及现有关键蛋白识别方法的挖掘效率和预测准确率不高等问题,提出一种基于复合物信息和亚细胞定位信息(united protein complexes and subcellular locallizations,PCSL)来识别关键蛋白质。首先,整合PPI网络的拓扑属性、生物属性和空间属性构建加权网络,以降低PPI网络中噪声的影响,达到提升PPI网络的可靠性的目的;其次,根据复合物信息和空间信息,设计一种衡量蛋白质关键性的度量,从多维角度强化关键蛋白质在PPI中的重要程度;最后,利用基于PPI网络拓扑特性的寻优算法,设计一种新的试探策略,提升挖掘关键蛋白质的效率。PCSL方法应用在DIP(database of interacting protein)数据集上进行验证。实验结果表明,与其他10种关键蛋白质识别方法相比较,该方法具有较好的识别性能,能够识别更多的关键蛋白质。     

2-苯基吲哚-5-磺酸的合成及表征

采用对磺酸苯乙酮苯腙闭环合成2-苯基吲哚-5-磺酸,首先研究合成目标产物的中间体——对磺酸苯乙酮苯腙制备过程中的酸度及反应时间对制备反应的影响,同时还选择了适当的溶剂.接着又考察了反应物配比、温度及反应时间对目标产物合成反应的影响,并对产物结构进行了表征.实验表明,产品不仅纯度好,且收率高,结果令人满意.