利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.     

氧化应激促进重组腺相关病毒2型体外转导分析

为揭示氧化应激在重组腺相关病毒2型(rAAV2)转导中的作用,以过氧化氢(H₂O₂)和铁过载(Fe-NTA)氧化应激为模型,在293T,LO-2,Hela,A549细胞中,从转基因表达量、阳性细胞数、基因组数和病毒衣壳分布等方面研究氧化应激对rAAV2转导的影响.实验结果表明:H₂O₂和Fe-NTA能促进rAAV2转导,转基因表达量、阳性细胞数、基因组数与对照组相比的差异具有显著的统计学意义;细胞转导12 h后,氧化应激组核周围衣壳分布数目显著比对照组多,氧化应激能够促使rAAV2长时间聚集在细胞核周围;当氧化应激产生的活性氧(ROS)被N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)消除,则氧化应激促rAAV2转导作用消失,说明氧化应激通过ROS发挥促进rAAV2转导作用.     

重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备

构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115(his4)中,经最小葡萄糖培养基(MD平板)筛选出阳性表达菌株并进行聚合酶链式反应(PCR)验证.菌株发酵上清液经Sephadex G-25,Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,相对分子质量约为24ku.结果表明:重组人VEGF165蛋白能诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖,提高HUVEC细胞的活性;重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体效价达1:51 200.     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白，并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒，提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后，用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达MVM VP2重组蛋白，经Western blot和IFA检测分析，重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性，为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

重组腺相关病毒的小量制备与体内体外感染研究

 重组腺相关病毒(rAAV)是近年来发展的较为成熟的一种病毒基因载体, 常用于过表达或者敲低等动物模型的建立与基因治疗等。本研究使用三质粒共转染的方法, 在HEK293细胞中包装出含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的rAAV, 通过一系列实验, 确定纯化方法为脱氧胆酸钠裂解, 高浓度NaCl去除杂蛋白, 最后通过肝素层析柱纯化, 经超滤管浓缩后其滴度可达10¹³ gene copys/mL以上。将纯化后的rAAV 感染HEK293 细胞, 通过实验确定使用感染复数为10⁶、感染3 d 的细胞能够表达出高水平的EGFP。将rAAV注射入大鼠中脑黑质致密部, 经过3周的感染发现, rAAV可以特异性地感染多巴胺能神经元, 表达出EGFP。通过以上实验, 建立了一个在实验室小量制备rAAV的方法, 且此方法制备的rAAV完全满足体内与体外实验的要求。     

腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF受体FLT-1,KDR转录抑制血管形成

本研究用细菌内同源重组的方法构建了针对VEGF受体FLT-1,KDR的siRNA表达重组腺病毒Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR,感染HUVEC细胞,观察两种病毒对HUVEC细胞体外增殖和形成微血管的干扰作用.通过RT-PCR实验表明,Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR均可特异性地下调血管内皮细胞(HUVEC)中的FLT-1mRNA和KDR mRNA水平.与对照组相比,FLT-1的mRNA水平下降为40%,KDR的mRNA水平下降为52%.Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR对HUVEC细胞增殖均有干扰作用,加入病毒9 d后,对照组的细胞平均计数为31.5×104/μL,Ad H1-siRNA/FLT-1干扰病毒对照组为28×104/μL,Ad H1-siRNA/KDR干扰组为21.5×104/μL.Ad H1-siRNA/FLT-1和Ad H1-siRNA/KDR对HUVEC细胞在Matrigel上形成微血管均有干扰作用,对照组每HPF形成微血管数量为10.75条,Ad H1-siRNA/FLT-1干扰病毒对照组为10.25条,实验组Ad H1-siRNA/KDR每HPF形成微血管数量为7条.证明Ad H1-siRNA/FLT-1,Ad H1-siRNA/KDR均可干扰血管形成.     

小凹蛋白-1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达

为探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达及定位,为进一步功能研究提供理论依据,采用Western-blot和Rt-PCR及免疫荧光技术检测HUVEC中小凹蛋白-1与细胞外钙受体mRNA和蛋白表达及定位.结果显示:(1)形态学观察和免疫细胞化学法测Ⅷ因子抗原,95%以上的细胞呈阳性着色,证实细胞为HUVEC.(2)RT-PCR检测到HUVEC中459bp和260bpmRNA表达,Western-blot测到HUVEC中22KD和150-160KD蛋白表达.(3)免疫荧光检测到小凹蛋白-1与细胞外钙受体定位于人脐静脉内皮细胞膜.由此可知,人的HUVEC中有小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达,两者是否共定位及其功能有待进一步研究.     

酵母重组表达PCV2病毒样颗粒的纯化工艺

猪圆环病毒(PCV)是一种引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道综合征及繁殖障碍的病毒,已经成为危害养猪业最主要的病原之一,而接种猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制猪圆环病毒相关疾病最有效的措施.利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)表达猪圆环病毒PCV2Cap的产量可达2g/L,高于其他表达系统的产量,并且重组表达的Cap蛋白在胞内能高效自组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs).酵母细胞破碎之后样品中含有大量的微小的细胞碎片,高速离心澄清难以分离,影响了VLPs的得率、纯度以及澄清度.本研究考察了超声波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高压均质破碎等不同破碎方法,发现1 300bar高压均质法对重组表达PCV Cap蛋白的马克斯克鲁维酵母破碎效果最佳.在此基础上,检测添加有机溶剂、表面活性剂和化学絮凝剂的处理效果,发现添加1%(质量分数)Triton X-100对酵母破碎菌液具有65%以上的浊度降低率,处理后样品可直接用于离子交换层析,得率大于92%,HPLC纯度大于85%.     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

超滤法去除重组腺相关病毒中内毒素的应用

为探讨超滤法在重组腺相关病毒精制中的可行性,采用不同截留分子量的超滤管对重组腺相关病毒样品rAAV9-Kal进行超滤处理.利用鲎试剂盒和qPCR法定量检测截留液和滤过液中的内毒素和病毒含量,评价超滤技术对样品中内毒素的去除效果.结果表明:在乙二胺四乙酸二钠和脱氧胆酸钠的预处理下,30 kD的超滤管对样品的回收率及内毒素去除率分别为0.912 2,0.870 6.因此,在单一超滤条件下,30 kD的超滤管是重组腺相关病毒样品超滤纯化的最佳选择.