贵阳市食品中沙门氏菌污染检测

利用沙门氏菌inv A基因序列设计引物并建立PCR反应,该反应灵敏度为3.6×102CFU/m L。在1m L样中含菌量106CFU/m L时增菌4h、含菌量103CFU/m L时增菌8h、含菌量102CFU/m L时增菌12h后可检出。从贵阳市各区随机购买113份肉、蛋类食品,检出10份样品含有沙门氏菌,总检出率为8.8%。该方法准确、灵敏、快捷、成本低,可广泛应用于沙门氏菌检测。     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

EHEC O157:H7紧密黏附素C300与LTB融合基因克隆与序列分析

目的构建肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7紧密黏附素C-端免疫保护片段与肠黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合基因克隆载体,为进一步研究EHEC O157:H7重组疫苗奠定了基础.方法设计引物采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增Intimin C300的编码基因,从肠产毒性大肠埃希菌基因组中扩增LTB的编码基因,分别构建克隆载体pUC18-C300和pUC18-LTB,采用酶切位点相连技术,构建pUC19-C300-LTB克隆载体,并测序.结果从EHEC O157:H7基因组中扩增出了900 bp的目的片段,从肠产毒素大肠埃希菌基因组扩增出了275 bp的目的片段,分别插入载体pUC18和pUC19,经酶切及测序鉴定与目的序列一致.结论克隆出EHEC O157:H7的紧密黏附素C-端免疫保护片段与不耐热肠毒素B亚单位基因,并成功构建融合基因克隆载体,测序正确.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

多重PCR检测病死鸡中沙门氏菌方法的研究

为了建立能够同时检测病死鸡样品中的沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的多重PCR 方法.采用煮沸法提取 DNA 做为模板,选择分别针对沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异性基因(invA、fliC、sdfⅠ)设计引物,优化反应体系和反应参数,建立多重PCR检测方法.应用该方法对国内17家鸡场369份病死鸡样品进行沙门氏菌的检测,检测结果与传统细菌培养法的结果进行比较.结果表明,优化过的多重 PCR 可同时对沙门氏菌种、属进行鉴定,灵敏度为4.6×102 CFU/mL;多重 PCR 方法共检测出沙门氏菌34株,其中鸡白痢沙门氏菌21株、肠炎沙门氏菌5株,与传统细菌培养法检测结果的符合率分别为91.2%、90.5%和80.0%.     

一种快速检测蛋鸡沙门氏菌的方法

为检测蛋鸡泄殖腔拭子中沙门氏菌,在基础培养基BPW的基础上,优化出了培养仅需6 h的选择性增菌液SEM;并根据蛋鸡泄殖腔拭子中的非沙门氏菌干扰菌种类,设计了沙门氏菌特异性检测引物hilAP3.结果表明：1)低数量(1~5 CFU/50mL)沙门氏菌在优化后的一步法选择性增菌液SEM中培养6 h 后,其生长量可达103 CFU/mL 以上,可满足 PCR方法的检测限(102 CFU/mL);2)hilAP3引物能排除蛋鸡泄殖腔拭子中的非目标菌的干扰,特异地检测其中的沙门氏菌;3)建立的SEM增菌6 h与hilAP3特异引物PCR联用的方法检测灵敏度为1~5 CFU/50mL,准确率为100%.因此,该研究中建立的优化增菌液与PCR联用法能在9h内完成沙门氏菌的检测,其灵敏度和特异性高,可应用于蛋鸡场的沙门氏菌检测.     

ERIC-PCR方法鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌研究

本研究工作共收集食物样品6种62份，从中分离单核细胞增生性李斯特氏菌可疑菌落，用ERIC PCR方法进行鉴定。并用国际生化方法验证，结果表明，两种鉴定方法结论完全一致，证明使用ERIC－PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌是可行的，并且耗时短，操作简单。     

大肠埃希菌ELISA检测条件的优化

目的对ELISA检测大肠埃希菌方法条件进行优化研究.方法以大肠埃希菌为对象,通过Box-Behnken设计星点响应面实验进行优化实验.结果优化后ELISA检测条件:抗原包被浓度为6.25μg/m L,抗原包被最佳时间为7 h,抗体稀释度最佳为1∶625 0,大肠埃希菌ELISA检测OD值为2.12.结论经实验得证,通过星点响应面实验方法进行大肠埃希菌ELISA检测条件优化,结果合理有效,优化效果良好.     

PCR-DHPLC技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．     

POR-DHPLO技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．     

MUG单管定量检测法对大肠埃希氏菌的检测

采用MUG单管定量检测法对实验室制备的菌悬液、天然海水、水产品进行定量检测,并与大肠埃希氏菌多管发酵法的检测结果进行比对分析.结果表明：MUG单管定量检测法与大肠埃希氏菌多管发酵法对菌悬液、天然海水、水产品的检测结果没有统计学差异;MUG单管定量检测法检测数据的精确性高于大肠埃希氏菌多管发酵法,而且更为快速、经济.因此,该法适用于海水和水产品中大肠埃希氏菌的定量检测.     

肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌携带β-葡萄糖醛酸酶基因的鉴定与特征

目的探讨肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌携带β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase,GUS)基因序列变化特征,为肠癌的防治与诊断提供新的思路.方法采集肠癌患者晨起粪便,常规方法分离大肠埃希菌,提取细菌基因组DNA,设计GUS基因特异性引物,进行PCR扩增及测序分析.结果 10例肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌均携带GUS基因,与Gen Bank(Acession No.S69414.1)uid A基因序列同源性为99%,分别在第1141和1148位A缺失,第1149位A突变成T,第1158位A突变成G.结论肠癌患者大肠埃希菌GUS基因同时出现基因突变和缺失,可成为肠癌诊断的新标记物.     

海鱼中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检测

检测了来自4个商场的20种海鱼,共120个样品,按3管MPN计数法每100 g鱼肉中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的平均值分别为396.72和214.78,平均出现率各为80.8%和43.3%,其中4月份的李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数量远高于其它月份;按季节分,则各数值从大到小依次是春季、秋季、夏季和冬季;检测次数在3次以上的不同种类海鱼中都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出,其数量和出现率与海鱼的种类密切相关,其中海鲶中的感染最严重;各个商场的海鱼都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出;所分离的单核细胞增生李氏菌的血清型以1型和4型为主。     

一种利用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法

利用微波加热原理,探索一种快速、简单、高效提取细菌DNA用于常规PCR快速检测的方法。在微波炉额定功率800 W条件下分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌以及志贺氏菌6种常见食源性病原菌进行微波处理,离心取上清,获取细菌DNA,将样本DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳进行验证。并进一步采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度和混合提取6种病原菌DNA的PCR检测进行分析。6种病原菌在微波炉中加热40-130 s的上清DNA样本均能用于常规PCR扩增。针对检出浓度的分析表明,副溶血弧菌的最低检出浓度为103 cfu/ml,金黄色葡萄球菌为104 cfu/ml,肠出血性大肠杆菌为105 cfu/ml,肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的最低检出浓度为106 cfu/ml,针对单核细胞增生李斯特氏杆菌的的最低检出浓度为107 cfu/ml。进行6种混合菌微波共提取时,其中5种病原菌的特异性基因都能扩出,并且条带很亮。该微波提取方法具有快速,简单,高效的特点,能满足大部分食源性病原菌的常规PCR检测需求,大大节约了时间和成本,具有广泛的适用性,为细菌快速分子检测提供了简便手段。     

一种采用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法

利用微波加热原理,探索一种快速、简单、高效提取细菌DNA用于常规PCR快速检测的方法.在微波炉额定功率800 W条件下分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌以及志贺氏菌6种常见食源性病原菌进行微波处理,离心取上清,获取细菌DNA,将样本DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳进行验证.并进一步采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度和混合提取6种病原菌DNA的PCR检测进行分析.6种病原菌在微波炉中加热40-130 s的上清DNA样本均能用于常规PCR扩增.针对检出浓度的分析表明,副溶血弧菌的最低检出浓度为103cfu/ml,金黄色葡萄球菌为104cfu/ml,肠出血性大肠杆菌为105cfu/ml,肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的最低检出浓度为106cfu/ml,针对单核细胞增生李斯特氏杆菌的的最低检出浓度为107cfu/ml.进行6种混合菌微波共提取时,其中5种病原菌的特异性基因都能扩出,并且条带很亮.该微波提取方法具有快速,简单,高效的特点,能满足大部分食源性病原菌的常规PCR检测需求,大大节约了时间和成本,具有广泛的适用性,为细菌快速分子检测提供了简便手段.     

儿童大肠埃希菌产ESBLs检测及耐药分析

目的分析吉林地区儿童产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药特点,以指导临床用药.方法用双纸片协同试验检测115株大肠埃希菌产ESBLs的情况,并用K-B纸片扩散法对其耐药性进行了检测.结果产ESBLs大肠埃希菌为36株,阳性率为31.3%;产ESBLs大肠埃希菌对多种抗生素的耐药率高于非产ESBLs大肠埃希菌;所有大肠埃希菌均对亚胺培南敏感.结论吉林地区儿童产ESBLs的大肠埃希菌检出率高并呈多重耐药性.临床治疗中应严格掌握抗菌药物应用指征,并动态监测其耐药性变迁,防止ESBLs大肠埃希菌的局部流行.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究

目的 研究从腹泻实验兔分离到的大肠埃希菌的生物学特性。方法 对一株从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌的遗传谱系、抗生素敏感性、消毒液敏感性以及细菌携带的耐药基因和毒力基因进行较为全面的研究。结果 该大肠埃希菌属于B1型遗传谱系，携带毒力基因eaeA,属于肠致病性大肠埃希菌。对常用的5种消毒液敏感，对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等11种抗生素耐药，携带aadA1,gyrA,sul1和tetA等4个抗生素耐药基因。结论 从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌为一株B1型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌，具有多重耐药性，对常用的消毒剂均敏感。     

牛板筋中单核细胞增生李斯特氏菌的检测研究

单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,对食品安全和人类健康具有危险性。本文通过对牛板筋中单增李斯特菌检测的微生物法、全自动微生物鉴定仪法和荧光PCR法这3种方法进行研究,得出结论:3种方法结果具有较高一致性,其中荧光PCR法快速、高效,在食品安全抽检和监测工作中值得应用和推广。     

食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性，在对26种病原菌进行检测过程中，运用实时荧光PCR法和经典培养法进行比较，结果表明用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感、特异性更高。