单环刺螠不同部位中纤溶酶的分离纯化及其活性差异

对单环刺螠不同部位中的纤溶酶(UFE)进行分离纯化,并比较其活性差异.选择单环刺螠体壁肌、内脏、体腔液作为UFE的提取来源,通过离心分离、SephacrylS 100凝胶柱层析、Q-Sepharose fast flow阴离子交换层析等工艺获得UFE单一组分,采用Folin-酚试剂法测定其酶活性,并研究UFE对AT-Ⅲ,HC-Ⅱ,凝血因子和钙离子的影响,验证不同部位UFE的活性差异.结果表明:从秋季单环刺螠体腔液中提取的总蛋白质量为39.8 mg,UFE的比活力为4 695.94 mkat·g^-1,纯化倍数为13.8,明显优于内脏和体壁肌的提取所得;在抗凝作用实验中,加入体腔液中所得UFE后,标准血浆、乏AT-Ⅲ血浆和乏HC-Ⅱ血浆凝血酶原时间、凝血酶时间均极显著延长,加入不同浓度氯化钙后,能显著延长凝血时间,同时,能够极显著降低凝血因子Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹ,Ⅻ的活性及大鼠血液中的钙离子浓度;不同部位来源的UFE活性有较大差异,与内脏及体壁肌相比,体腔液为UFE更优提取部位.     

3种重金属离子对单环刺螠幼螠的急性毒性研究

采用静水试验法,在水温19.0±1.0℃的条件下,用Cu~(2+)、Hg~(2+)、Cd~(2+)3种重金属离子对体重1.2±0.16 g的单环刺蜢幼蜢进行了单一因子急性毒性试验.结果表明,3种重金属离子毒性大小依次为Hg~(2+)Cu~(2+)Cd~(2+),幼蜢在3种重金属离子溶液中呈现出不同的生物学效应.Cu~(2+)对幼蜢的24 h、48 h LC_(50)分别为1.768、1.408 mg/L;Hg~(2+)的24h、48 h LC_(50)分别为1.097、0.770 mg/L;Cd~(2+)的24 h、48 h LC_(50)分别为2.084、1.789 mg/L.Cu~(2+)、Hg~(2+)、Cd~(2+)对幼蜢的安全浓度分别为0.141、0.077、0.179 mg/L.     

单环刺螠对刺参养殖池塘底质的影响

对刺参单养池、刺参与单环刺螠混养池等养殖池中底泥硫化物、总碳(TC)、总氮(TN)、总磷(TP)、化学需氧量(COD)等指标进行检测对比,结果发现,单环刺螠与刺参混养模式下,底泥中硫化物、TC、TN、TP、COD的含量显著低于刺参单养池,表明单环刺螠对养殖池中底泥相关指标尤其硫化物具有改良效果.通过刺参单养池中硫化物与其他指标的相关性研究发现:硫化物与TC呈显著性正相关,r(相关系数)为0.933 0;与COD呈非显著性正相关,r为0.815 4;与TP呈非显著性正相关,r为0.727 7;与TN呈非显著性负相关,r为-0.161 0.经综合分析,该研究认为:单环刺螠在养殖池底泥指标的改良方面具有积极意义,可为刺参养殖池的生物修复提供理论依据.     

单环刺螠（Urechis unicinctus）废弃内脏营养成分分析

对烟台市售单环刺螠废弃内脏进行了营养成分分析,结果表明:单环刺螠新鲜废弃内脏蛋白质含量为18.25%,脂肪含量为0.12%,总糖含量为4.09%,灰分为14.30%,Ca为2.10%,Mg为0.41%,Fe为0.32%,Zn为0.03%;对单环刺螠废弃内脏的脂肪酸分析发现,EPA、DHA和DPA均较为丰富,分别占总脂肪酸的21.61%、3.67%和56 24%.单环刺螠废弃内脏具有很好的开发利用价值.     

产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化

为了获得纯纤溶酶并探讨其酶学性质,从广泛收集的豆豉中筛选到一株具有高产纤溶酶能力的菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌.将该菌突变株DC-12N8的发酵液经离心除菌、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,获得电泳纯的豆豉纤溶酶,每升发酵液可得到4.5mg活性酶蛋白,每克酶蛋白活力达1.18mol/s,纯度为发酵原液的53.6倍,回收率为11.7%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,该酶是单链蛋白质,其分子质量约为28ku.     

蛹虫草纤溶酶酶学性质的初步研究

对蛹虫草纤溶酶的酶学性质进行了研究,结果表明,其纤溶活性随温度(≤45℃)的升高和保温时间的延长,逐渐下降,当温度超过50℃时,则随温度的升高和保温时间的延长急剧下降;蛹虫草纤溶酶的最适pH为7.0,在碱性条件下纤溶活性相对稳定;金属离子Ca2+和Fe2+对蛹虫草纤溶酶的活性有显著激活作用;抑制剂中PMSF对蛹虫草纤溶酶活性的抑制作用较小,而Aprotinin、EDAT和EGTA对其纤溶活性均有较显著的抑制作用,说明蛹虫草纤溶酶可能不同于之前报道的纳豆激酶(丝氨酸蛋白酶),而是一种全新的蛋白酶,但对这一点还需要进一步的研究验证.     

豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

蚯蚓纤溶酶研究进展

蚯蚓纤溶酶是蚯蚓体内含量十分丰富的一种血纤维蛋白水解酶。自1982年日本宫崎医科大学美原恒首先报道蚯蚓体内存在这种酶以来,我国兰州大学:中科院生物物理所、中科院上海生化所、渝州大学、北京大学以及清华大学、山西医学院等单位,相继对蚯蚓纤溶酶的分离纯化工艺、理化性质、生物学活性等方面都进行了广泛的研究。现就研究的进展情况,结合本人的工作介绍如下。     

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

脉孢菌纤溶酶的纯化和性质初步研究

应用超滤、盐析、凝胶过滤和疏水相互作用层析对脉孢菌产纤溶酶初步纯化后,活性电泳证实获得单一的纤溶活性组分。对该纤溶组分的基本酶学性质作了进一步的研究,结果表明该纤溶酶的最适作用温度和最适pH分别是46℃和7.8,在40℃以下和pH6.2~7.8时稳定,该纤溶酶具有直接和间接的纤溶活性。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶原基因的初步研究

从桂北五步蛇毒腺中抽提蛇毒总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一试管内进行）扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,并进行电泳检测,可见３条特异的ＤＮＡ条带,分别约为１．５Ｋｂ、１．３Ｋｂ和８００ｂｐ,利用平端连接的方法将其中的８００ｂｐＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定。     

蚯蚓纤溶酶同工酶的分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）分析了赤子爱胜蚓和秉氏环毛蚓的两个不同部位的纤溶酶同工酶酶谱。表明纤溶酶主要存在于蚯蚓的内容物中,秉氏环毛蚓内容物中的纤溶酶种类多于赤子爱胜蚓。提示用秉氏环毛蚓内容物提取蚯蚓纤溶酶,效果较好。     

微生物源纤溶酶的研究进展

本文阐述了微生物发酵生产纤溶酶的研究背景，并对几种主要的纤溶酶的来源及理化特征和作用机理进行分析和总结，为寻找新型的、相对廉价有效的溶栓药物提供了依据。     

微生物发酵生产纤溶酶的研究

以一株具有高产纤溶酶能力的菌株中国根霉１２＃为出发菌株，以麸皮、胰蛋白胨为培养基，采用液体发酵法生产一种高效血栓溶解酶。用人工血纤维蛋白平板检测其活性。对培养基中的碳源、氮源、浓度及配比进行了研究，通过正交试验设计了最佳培养基配方和培养条件，并进行了扩大培养实验     

蚯蚓纤溶酶热稳定性的研究

在37～65℃范围内对蚯蚓纤溶酶的热稳定性进行了实践研究。表明:蚯蚓纤溶酶的干燥粉末热稳定性好且耐贮藏。据实验预测其有效版为11年。     

微生物源纤溶酶的研究进展

溶栓疗法是目前用于治疗血栓性疾病安全可靠并且有效的方法,采用传统的溶栓药物在治疗血栓病上已经取得了显著的成绩,但还是存在着一定的缺陷,所以应用也受限制.目前,利用微生物发酵产生的纤溶酶制成新型的溶栓药物已成为研究热点.本文对从不同微生物中所提取和纯化的纤溶酶的理化性质、结构特征、生物学活性及开发现状等方面的研究资料进行...     

蚯蚓纤溶酶总RNA的提取及电泳分析

分离提取纯净完整的RNA对于分子克隆实验是很重要的,而且是进行基因表达分析的基础。本实验通过总RNA纯化试剂盒(V-gene Total RNA Purification Kit)从蚯蚓体内提取蚯蚓纤溶酶总RNA,为下一步进行RT-PCR等分子克隆实验打下了基础。