文昌鱼碱性磷酸酶的动力学初步研究

从厦门文昌鱼中部份提纯一种碱性磷酸酶,并对该酶作用的动力学进行了初步的研究。该酶作用于底物磷酸苯二钠的最适pH为10.1,最适温度为40℃,测得其米氏常数值(K_m)为1.1×10~(-3)M,pH影响K_m值而不影响最大反应速度(V),表现为竞争性类型。Mg~( )有明显的激活作用,而Zn~( ),EDTA,DFP,ME及PCMB等在一定浓度范围内,表现为非竞争抑制类型。ME的抑制作用表明硫硫键是维持酶活力所必需的。从pH对酶的活力影响,测得有关酶活性基团解离的pK值为9.82,在不同温度条件下,测得该酶的活化能为3.16仟卡/克分子,其温度系数为1.15(30—40℃)。     

磷酸盐及其结构类似物对文昌鱼酸性磷酸酶的影响

研究了磷酸盐（ＨＰＯ￣（２－）＿４）及其结构类似物钼酸盐（ＭｏＯ￣（２－）＿４），钒酸盐（ＨｖＯ￣（２－）＿４），钨酸盐（ＷＯ￣（２－）＿４）对文昌鱼酸性磷酸酶活力的影响及其抑制机理。实验结果表明：磷酸盐对文昌鱼酸性磷酸酶的抑制作用表现为竞争性抑制类型，而其结构类似物则是通过非竞争性抑制的方式抑制酶活力．抑制常数Ｋｉ分别为：磷酸盐：３．０×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ，钼酸盐：５．５×１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ，钒酸盐：７．０×１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ，钨酸盐：３．８×１０￣（－８）ｍｏｌ／Ｌ，用酸盐对酶活力呈时间抑制过程，表明该类似物可能通过氧化—还原这种新的抑制机理来抑制酶的活力。     

文昌鱼碱性磷酸酶的热力学特征初步研究

从厦门文昌鱼中,获得提纯200倍的经聚丙稀酰胺凝胶电泳鉴定为均一的碱性磷酸酶。从热力学及热失活动力学角度初步探索了改变酶的结构对酶活力的影响。实验结果初步表明:在pH10.1时酶作用于对硝基苯磷酸钠的K_m值随反应温度的增高(25、30、35℃)而相应的增大(分别为5.81×10~(-4),8.09×10~(-4)及9.30×10~(-4)M)。其一级反应速度常数k_p分别为1.88×10~(-4),2.25×10~(-4)及2.31×10~(-4)秒~(-1)。天然第一态与变性第二态酶催化反应的活化能Ea分别为10.09 kcal/mole及4.51 kcal/mole,△H_1为24.09 kcal/mole及△s_1为74.44e.u.。在pH10.1时,酶促反应呈现一个严格的转化温度(32-35℃)。据活力计算,自然酶变性酶的二态可逆变性反应的热力学参数△S之值,认为酶局部变性,酶分子开始部分伸展,可能涉及三个氢键被破坏,但未涉及酶的总体结构。     

文昌鱼碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成的初步研究

经凝胶过滤法测得文昌鱼(Bronchiostoma belcheheri Gray)碱性磷酸酶的分子量为138,000,用等电聚焦电泳法测得其等电点为4.79,用氨基酸自动分析仪测得该酶的氨基酸组成共20种和1117个氨基酸残基。     

文昌鱼的酶学研究——Ⅰ.偏碱性蛋白酶的分离提纯及其动力学的初步研究

通过硫酸铵分级分离,DEAE—交换纤维素柱层析及SephadexG-200凝胶过泸等方法,从厦门文昌鱼中部份提纯一种偏碱性蛋白酶,并对该酶的某些性质作了初步的研究.该酶作用于酪蛋白的最适pH为7.0,最适温度30℃,测得其米代常数(K_M)值为3.08×10~(-4)M,而pH不影响其K_M值。对几种蛋白质的水解速度不同,其中对血红红蛋白的水解速度最快。某些化学试剂如半胱氨酸及谷胱甘肽(都为10~(-3)M)能增进酶活力,而P-CMB及碘代乙酰胺(都为10~(-3)M)则比较明显的降低酶活力。     

一种麦芽酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

经硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose CL 4B和DEAE-Sepharose CL 4B离子交换柱层析等步骤,从麦芽中分离提纯到一种酸性磷酸酶(ACPase,E．C．3．1．3．2),纯化倍数为33．06,酶液比活为88．27 U/mg．通过动力学方法测得其最适pH为5．4,酸碱稳定性较差,仅在pH 6．0左右的缓冲液中较稳定;最适温度为50 ℃,40 ℃以下有较好的稳定性;在最适条件下,该酶催化pNPP的米氏常数(Km)为4．696×10-4 mol/L．同时研究了一些金属离子和有机化合物对该酶     

文昌鱼酸性磷酸酶在甲醇溶液中的构象与活力变化

文昌鱼酸性磷酸酶（ＡＣＰａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．１．３．２）是一种含有铁离子的金属酶，其可见光谱中５００ｎｍ的吸收峰以及荧光５１５ｎｍ的发射峰为该酶分子含铁的特征峰，与酶活力关系密切．通过荧光发射光谱和紫外可见光谱对该酶在不同浓度甲醇溶液中的构象与活力变化进行研究．不同浓度（Ｖ／Ｖ）的甲醇对酶活力有明显的抑制作用，动力学分析表明甲醇对酶的抑制为非竞争性抑制，其抑制常数为２０％．还研究了在甲醇存在下ＡＣＰａｓｅ活力中心的构象与活力变化，结果表明其构象变化快于活力变化．     

背角无齿蚌酸性磷酸酶的分离、纯化及部分性质研究

从背角无齿蚌外套膜中,经盐析,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ,Ｇ－１５０凝胶过滤等步骤,分离提纯到一种酸性磷酸酶,提纯倍数８８．２５酶液比活力为２４．７Ｕ／ｍｇ,通过动力学方法测得其最适ｐＨ值为４．８,最适温度为５０℃,同样以对硝基苯磷酸二钠作底物测得其Ｋｍ值为０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ ,Ｚｎ＾２＋对酶有激活作用,而Ｆ＾－,Ｐｂ＾２＋和Ｂａ＾２＋则对酶有一定的抑制     

文昌鱼碱性磷酸酶的必需基团研究

对文昌鱼碱性磷酸酶的化学修饰研究结果表明:二硫键、赖氨酸残基和色氨酸残基与酶活性有关系。动力学方法测定酶活性基团的解离常数PK值为10.3,这数值与赖氨酸的ε-氨基的解离有关。活性基团的定量分析表明每个酶分子只有一个色氨酸残基是酶活性所必需的。     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

文昌鱼酸性磷酸酶在变性剂变性时的构象及活力变化的研究

十二烷基硫酸锂(LDS),脲(Urea)等变性剂作用于ACPase,以荧光法跟踪该酶的构象变化,随着LDS浓度提高荧光强度下降但发射峰没有位移,而在Urea中,荧光强度随着变性剂浓度上升而下降,发射峰明星红移,由330～350nm,分别测定其变性及失活的动力学常数,比较酶构象及催化活力的关系,结果表明:变性与失活为快相和慢相的一级反应,在LDS作用下,失活速度大于变性速度,属于快活力慢构象变化的模式,Urea的作用为变性速度大于失活速度,属于快构象慢活力变化的另一种模式,Urea作用后的变性酶,在测定其活力的10min内,没有观察到底物对变性酶的修复作用,以及稀释对变性酶的复活效应。     

文昌鱼酸性磷酸酶在变性剂变性时的构象及活力变…

十二烷基硫酸锂（ＬＤＳ），脲（Ｕｒｅａ）等变性剂作用于ＡＣＰａｓｅ，以荧光法跟踪该酶的构象变化，随着ＬＤＳ浓度提高荧光强度下降但发射峰没有位移，而在Ｕｒｅａ中，荧光强度随着变性剂浓度上升而下降，发射峰明显红移，由３３０－３５０ｎｍ。分别测定其变性及失活的动力学常数，比较酶构象及催化活力的关系，结果表明：变性与失活为快相和慢相的一级反应，在ＬＤＳ作用下，失活速度大于变性速度，属于快活力慢构象变化的…     

果胶酶的分离提纯及某些性质研究

本文报导了一种制备高纯度果胶酶的方法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得其分子量为32000,用等电聚焦电泳法测得其等电点为pH8.0～8.2,用圆二色谱测得此酶呈无规则卷曲构象。     

黑曲霉糖化酶的分离提纯及性质研究

采用硫铵分级、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤等方法,从黑曲霉A.S.3.4309变异菌B-11的发酵液中,分离出三种电泳均一的糖化酶(G I.GⅡ和GⅢ)。收率分别为0.8％,50％和18.6％。性质研究表明,G I,GⅡ和GⅢ均由一条多肽链组成。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶的化学修饰

用DEAE-纤维素(DE-22)并改进酶的提纯方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶制剂比活力为359μM/mg(E)/min(Npp为底物)·用凝胶过滤法测得该酶分子量为58600,氨基酸组成有20种,共467个氨基酸残基。10~(-4)M pCMB使酶活力丧失98％;1×10~(-3)M PMSP该酶活力丧失96％,2×10~(-4)M NBS以及1×10~(-2)M BrAc酶活力均丧失90％·酶修饰失活呈一级反应,修饰过的酶紫外280nm吸收峰消失·初步判断文昌鱼AcPase分子上的Cys,Trp,His,Ser等氨基酸残基可能是酶的活力必需基团。     

长毛对虾酸性磷酸酶的纯化与性质

分别从健康和患病长毛对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｐｅｎｉｃｉｌａｔｕｓ）肌肉提取一种酸性磷酸酶（ＡＣ－Ｐａｅ，ＥＣ．３．１．３．２．），进一步用硫酸铵分级分离，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，并于ＢｅｃｋｍａｎＤＵ－８Ｂ紫外分光光度计扫描为单一区带酶液。该酶紫外吸峰在２８０ｎｍ处，荧光激发峰在２８４ｎｍ处，发射峰在３４７ｎｍ处。酶的分子量为７３０００道尔顿，等电点为４．７酶水解对硝基苯磷酸二钠（ＰＵＰＰ）最适ｐＨ为４．５，最适温度４０℃。健康虾与病虾酶的活化能分别为４１．０３ｋＪ／ｍｏｌ·Ｌ和４５．７８ｋＪ／ｍｏｌ·Ｌ，米多常数ｋｍ值分别为０．８０×１０－４ｍｏｌ／Ｌ和１．４３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ。重金属离子Ｃｕ２＋，Ｈｇ２＋，有机溶剂甲醇，乙醇，乙二醇等对ＡＣＰａｓｅ有明显的抑制作用。     

用快速蛋白液相层析（FPLC）法纯化文昌鱼酸性磷酸酶

从厦门文昌鱼体内提纯了一种酸性磷酸酶，用快速蛋白液相层析法（ＦＰＬＣ）的Ｓｕ－ｐｅｒｏｓｅ１２柱和ＭｏｎｏＳ柱对其进一步纯化，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＦＰＬＣ的Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２柱鉴定为单一纯的酶制剂．它的分子量为５２０００，经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定该酶为二聚体．酶的提纯倍数为６１２．５２．     

中华猕猴桃蛋白酶分离提纯及性质研究

以中华猕猴桃鲜果为材料,经调节pH,硫酸铵盐析,除果胶以及DEAE—纤维素(E22)柱层折纯化,获得电泳单一区带酶制剂。以牛碳氧血红蛋白为底物,酶的最适温度为45—50℃,最适pH为3.7—4.0,K_m值为2.78×10~(-5)M,K_(cat)为2.01×10~2/min,pH影响V_(max)而不影响K_m值,表现为非竞争性抑制作用。该酶的活活化能为6.84kcal/mol,ΔH为6.24—6.20kcal/mol(30—50℃),同时还进行了酶的热稳定性研究。     

鲍鱼碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

以杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏为原料,经Tris HCl缓冲液(pH 7.5,含0.1mol/L NaCl)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级沉淀分离,DE 32离子交换、Sephadex G 150分子筛、DE 32纯化,得到电泳单一纯的碱性磷酸酶制剂,比活力为1 226 U/mg.酶学性质和动力学性质研究表明:该酶催化对硝基苯磷酸水解反应的最适 pH值为 10.08,最适温度为48℃.米氏常数Km 值为0.80 mmol/L,Vm 值为20.1 mmol/L·min-1(pH 10.0,37℃).酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 7~11区间和在温度低于55℃下稳定.金属离子对酶活力的影响结果表明:Li+、Na+和K+对酶活力没有影响,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+和Co2+对酶有不同程度的激活作用,而Cu2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Bi2+和Pb2+等对酶起抑制作用.     

Alq提纯的改进及其性质研究

在单温区温度梯度升华法的原有设备基础上加以改进，制备了双温区同加热的温度升华设备，并以8－羟基喹啉铝（Alq)为原料进行了多次提纯，实验结果表明原料的提纯时间大大缩短，对提纯后的8－羟基喹啉铝（Alq)的X射线衍射光谱，紫外－可见吸收光谱，原子力显微光谱进行了详细研究，研究结果表明使用双温区同时加热的温度梯度升华设备多次提纯的Alq的提纯效果显著，其薄膜状态的光学性质及微观表面形貌的形态结构有所改善。