抗Der p 2单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:建立Der p 2(屋尘螨Ⅱ类变应原)杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der p 2单克隆抗体进行鉴定.方法:用重组Der p 2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体.采用间接ELISA法、Western blot法确定单克隆抗体的免疫球蛋白的类型和亚类、相对亲和力、特异性,对单克隆抗体进行鉴定.结果:获得3株能稳定分泌高效价Der p 2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1B6为IgG1类,1G11、4B1为IgG2a类.间接ELISA法检测细胞上清效价为104~105,腹水效价为105~106.Westernblot试验证明3株单抗与Der p 2蛋白均有特异性反应.结论:成功制备了3株抗Der p 2的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立Der p 2蛋白检测和纯化的方法奠定了基础.     

重组人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备

为制备人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体,制备并纯化了VEGF蛋白,通过免疫、细胞融合、筛选等方法获得了能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水,并用G蛋白(Protein G)亲和层析柱对抗体进行了纯化;采用间接ELISA及Western blot实验分别对纯化后的抗体进行了效价测定和特异性验证.结果表明:此方法可成功筛选出能稳定分泌VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化后腹水抗体效价为1∶1 024;Western blot检验证实制备的单克隆抗体能特异性识别VEGF蛋白.     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白A单克隆抗体的制备与鉴定

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)鞭毛蛋白A(FlaA)可作为临床诊断标志物,但目前尚无识别FlaA蛋白的特异性抗体.该研究构建了HpflaA基因表达质粒,表达并纯化了HpFlaA重组蛋白,并以此重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备HpFlaA单克隆抗体,最后对抗体的亚型、效价、纯度、亲和力和特异性等进行鉴定.共获得5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G2、2G10、3E2、3E4和4H3.这5株细胞分型均为IgG1型且抗体效价均超过1∶10~5,亲和常数均达到10~7以上.经间接酶联免疫吸附实验和蛋白质免疫印记实验验证,单克隆抗体能特异性识别HpFlaA.成功制备出高亲和力、高效价、特异性好的HpFlaA单克隆抗体,具有潜在临床应用价值.     

抗人FXYD6单克隆抗体的制备及鉴定

制备了抗人FXYD6单克隆抗体,并进行初步鉴定.以FXYD6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人FXYD6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定FXYD6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中FXYD6的表达.结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人FXYD6单克隆抗体2.86 mg;FXYD6单克隆抗体可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色.成功获得FXYD6单克隆抗体可以为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造条件.     

抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定

【摘要】目的 制备抗人FXYD3单克隆抗体（McAb）并鉴定其生物学特性。方法 以固相合成法获得的FXYD3合成多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人FXYD3 McAb。用ELISA 、Western Blot、免疫组化技术对抗人FXYD3 McAb的亚型、效价、亲和力及特异性进行鉴定。结果 筛选出两段较好的优势抗原表位,分别为NDLEDKNSPFY和KFGQKSGHHPGETPPLITPGSA获得四株可稳定分泌抗人FXYD3 McAb的杂交瘤细胞株02A12C4、02F1E8、02E6B10与03A10E11,亚型鉴定重链均为IgG1,轻链为kappa链。间接ELISA法测定效价均在为1∶104以上。其中02F1E8效价为1∶105以上,亲和常数为3.11?08 L / mol。免疫组化分析显示了FXYD3均匀分布于肝癌细胞与人胰腺癌Bxpc-3细胞系细胞的胞膜上。结论 成功制备了四株抗人FXYD3 McAb,其中02F1E8纯度好、效价高及特异性强。为进一步研究FXYD3在肿瘤组织及细胞系中的表达及临床意义奠定了基础。     

脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备

目的: 为建立脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体．方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠．取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接 ELISA 法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化．用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价．结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株I型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体．间接ELISA 法测得单抗的效价为1∶8,中和试验测得中和抗体的效价为1∶58．结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体.     

KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.     

小麦GLB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以小麦主要过敏原Glb-1蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用细胞融合和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水并用蛋白A亲和层析法纯化抗体后检测。采用间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的IgG亚型;通过间接ELISA鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心ELISA法检测单抗的抗原表位特异性。结果表明:共获得4株可稳定分泌小鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白的单克隆抗体,分别命名为1C4、4H5、1A9、4F5,经检测其Ig亚型均为IgG1,且4株单抗效价均在10-9以上。ELISA结果分析表明该4株单抗均能特异性识别小麦主要过敏原Glb-1蛋白且和其他常见食物无交叉反应性。将4株单抗两两配对进行ELISA实验,结果发现1C4与4H5可能有不同的抗原表位,以此建立的双抗夹心ELISA系统可以检测小麦Glb1-G3蛋白。实验成功制备了鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白抗原的单克隆抗体,并且建立了双单抗夹心ELISA检测系统,为小麦主要过敏原蛋白的检测奠定了基础。     

环氧合酶-2单克隆抗体的制备和初步应用

以合成肽COX-2-KLH为完全抗原免疫BALB/c 小鼠,通过脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合的杂交瘤技术,筛选获得4株(1E10、3D6、5B11、6G4)稳定分泌抗COX-2单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.采用ELISA的方法鉴定McAb效价、亚型及特异性.各株McAb均属IgG1 亚型,其中1E10腹水纯化后MCAb效价在1∶107以上,SDS-PAGE电泳为单一条带,与同源异构体蛋白不发生交叉反应.获得的McAb被成功应用于COX-2生物学研究中的免疫组织化学(IHC)和Western Blot试验中.本研究获得的单抗具有特异、高效的特点,为COX-2生物学相关研究提供理论依据.     

卡那霉素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

采用EDC法制备卡那霉素(KAN)完全抗原、卡那霉素-牛血清白蛋白(KAN-BSA)、卡那霉素-鸡卵清蛋白(KAN-OVA).用KAN-BSA完全抗原免疫BALB/c小鼠,并通过杂交瘤技术制备能够稳定分泌抗KAN单克隆抗体的杂交瘤细胞(1E1).通过体内诱生腹水大量制备单克隆抗体,鉴定1E1单克隆抗体,其效价为8×10~5,亲和力为2. 8×10~9L/mol,半数抑制浓度(IC50)为1. 09 ng/mL,与妥布霉素(TOB)的交叉反应率为53. 4%,与其他氨基糖苷类化合物没有交叉反应性.利用该单克隆抗体,建立KAN间接竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA).ciELISA检测KAN在牛奶中的回收率为64. 4%～89. 6%,最低检测限为1. 92 ng/mL.     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

A preliminary study on functional domains of small heat shock protein Hsp16.3

Hsp16.3, the small heat shock protein (sHSP) from Mycobacterium tuberculosis, was originally identified as an immunodominant antigen,which possesses three functional domains typical of sHSP family, namely the N-terminal hydrophobic region, α-crystallin domain and a short non-conserved C-terminal extension.To further understand the functional assignment of these independent regions, the three functional domains of Hsp16.3 were defined and the two N- or C-terminal truncated Hsp16.3 remnants were successfully cloned, expressed and purified.In the far and near circular dichroism analysis, the results showed that these remnants expressed similar secondary and tertiary structures to that of wild-type protein.During the reassembly of wild-type nonamer, the C-terminal truncated remnant could interact with the wild-type protein to form hetero-oligomers.When trypsin is used to digest the wild-type Hsp16.3, its α-crystallin domain could resist such degradation.Taken together, these results indicate that the stable secondary and tertiary structures of Hsp16.3 are mainly kept by its α-crystallin domain.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7／L12的单克隆抗体（mAb）,为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7／L12的mAb,并用Western blot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7／L12蛋白的mAb：1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2〉2H10〉2H9〉181,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7／L12蛋白。     

Monoclonal Antibodies Recognizing HIV-1 gp41 Could Inhibit Env-Mediated Syncytium Formation

Some monoclonal antibodies （mAbs） could inhibit infection by HIV-1. In this study, four mAbs against HIV-1 gp41 were prepared in mice. All four mAbs could bind to the recombinant soluble gp41 and recognize the native envelope glycoprotein gp160 expressed on the HIV-Env^＋ CHO-WT cell in flow cytometry analysis. Interestingly, the results show that all four mAbs purified by affinity chromatography could inhibit HIV-1 Env-mediated membrane fusion （syncytium formation） by 40%-60% at 10 μg/mL, which implies potential inhibitory activities against HIV-1.     

抗人PD-L1单克隆抗体的瞬转表达

利用HEK293 6E细胞瞬转表达抗人PD L1单克隆抗体. 将HEK293 6E细胞无血清悬浮培养, 筛选最佳生长培养基; 考察HEK293 6E细胞的筛选表达培养基、 DNA和PEI质量比及转染时细胞密度等转染条件, 并对收获的抗体进行SDS PAGE和ELISA鉴定. 结果表明: 在A无血清表达培养基中, 以2×106个/mL的细胞密度和m(DNA)∶m(PEI)=1的条件转染, 第4天收获抗体的产量最高, 为170.9 μg/mL; 收获PD-L1抗体的重链分子量约为50 000, 轻链分子量约为25 000.     

结核杆菌Ag85B的表达纯化

为构建抗结核病新型疫苗，以结核杆菌标准毒力株H37Rv DNA为模板，用PCR法克隆抗原85B的编码基因，将该基因重组到表达型质粒pQE30中，表达的His6 Tag-Ag85B融合蛋白分子质量约32ku，用亲和层析一步法纯化的重组蛋白纯度好，得率高，为进一步的免疫研究创造了条件。     

Predefined GPGRAFY-Epitope-Specific Monoclonal Antibodies with Different Activities for Recognizing Native HIV-1 gp120

A seven-amino acid epitope GPGRAFY at the tip of the V3 loop in HIV-1 gp120 is the principal neutralizing epitope, and a subset of anti-V3 antibodies specific for this epitope shows a broad range of neutralizing activity. GPGRAFY-epitope-specific neutralizing antibodies were produced using predefined GPGRAFY-epitope-specific peptides instead of a natural or recombinant gp120 bearing this epitope. All six monoclonal antibodies (mAbs) could recognize the GPGRAFY-epitope on peptides and two of the antibodies, 9D8 and 2D7, could recognize recombinant gp120 in enzymelinked immunosorkentassy (ELISA) assays. In the flow cytometry analysis, the mAbs 9D8 and 2D7 could bind to HIV-Env CHO-WT cells and the specific bindings could be inhibited by the GPGRAFY-epitope peptide, which suggests that these two mAbs could recognize the native envelope protein gp120 expressed on the cell membrane. However, in syncytium assays, none of the mAbs was capable of inhibiting HIV-Env-mediated cell membrane fusion. The different activities for recognizing native HIV-1 gp120 might be associated with different antibody affinities against the epitopes. The development of conformational mimics of the neutralization epitope in the gp120 V3 loop could elicit neutralizing mAbs with high affinity.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

一种新的高灵敏测定抗坏血酸的荧光分析法

提出了一种新的高灵敏测定抗坏血酸的荧光分析法.抗坏血酸与Cu2+在pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液中生成羟基自由基,然后羟基自由基与苯甲酸反应形成荧光物质.建立了测定抗坏血酸的适合条件,测定抗坏血酸的线性范围为(0.0128～1.92) ×10-6g/mL,方法的检测限是7.75×10-9g/mL.对于8.56 ×10-7g/mL的抗坏血酸测定6次,其相对标准偏差为1.6%.