C型产气荚膜梭菌PCR快速检测方法的建立

为了对产气荚膜梭菌进行快速检测,本研究以GenBank发表的产气荚膜梭菌α毒素、β毒素作为参考,应用生物学软件设计扩增C型产气荚膜梭菌α毒素和β毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp与927 bp;建立PCR反应体系并设置反应条件;反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明,设计的引物可以良好的扩增出C型产气荚膜梭菌的α毒素和β毒素基因,扩增的基因片段大小与预期的一致,阴性水对照与ε毒素对照扩增电泳泳道均为阴性。此方法用于判定C型产气荚膜梭菌的毒素型是可行的。     

多重聚合酶链反应检测污水中产气荚膜梭菌

根据产气荚膜梭菌产生4种主要毒素（α、β、ε、τ-毒素）可分为A～E5种菌型。依据产气荚膜梭菌的5种毒素基因的序列，设计5对PCR引物，建立多重聚合酶链式反应（PCR）方法，以快速区分5种类型的产气荚膜梭菌，68份环境样品（生活污水、屠宰场污水）的常规检测和基因分型共检出55株产气荚膜梭菌，其中A型产气荚膜梭菌51株，占总数的90%以上，B，C，D3种类型只占5%。试验未检出E型产气荚膜梭菌，所有的分离株未发现带有肠毒素，结果表明：目前污水中主要存在的菌型为A型菌，其他菌型的产气荚膜梭菌很少，而多数是非致病性产气荚膜梭菌。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理、检测及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。     

A型产气荚膜梭菌α毒素分子生物学的研究进展

A型产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症及人类创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,其致病因子是菌体产生的α毒素.近年来,对α毒素的分子生物学研究取得了重大进展,本工作就α毒素的检测方法、基因克隆与表达、结构与功能、氨基酸的组成对α毒素生物活性的影响以及抗α毒素单链抗体的研究进行了综述.     

B型产气荚膜梭菌β毒素的表达与纯化

将构建好的表达产气荚膜梭菌β毒素的重组质粒pET-32a-β转化大肠杆菌BL21(DE3),将得到的重组菌株BL21(DE3)(pET-32a-β)用IPTG进行诱导表达,探究其最佳诱导时间.对所表达的β毒素包涵体进行变性、纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性蛋白,动物免疫实验取得了良好的结果,为下一步抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体和单链抗体的研究奠定基础.     

产气荚膜梭菌ε毒素的细胞毒机制及致病机理的研究进展

产气荚膜梭菌ε毒素（Epsilon toxin ，ETX）由B、D型产气荚膜梭菌产生并分泌至宿主动物体内，在临床上主要症状为肠毒血症．ETX属于以七聚体形式存在的β‐样成孔毒素，它能够形成由14个β折叠片组成的“β‐桶状”结构，这个“β‐桶状”结构可以插入真核细胞的质膜形成穿孔．在细胞水平，ETX能够迅速使细胞膜肿胀、多种细胞器破坏，最终导致靶细胞的坏死．在哺乳动物体内，ETX能够使哺乳动物血管产生水肿，从而穿透血脑屏障而聚积在动物肾和脑中，导致机体随着谷氨酸盐的释放而产生过度兴奋，这一系列反应的发生可以引起机体出现脑水肿和肾衰竭，最终导致动物的死亡．目前， ETX备受关注的主要原因不仅仅因为它是一种β‐样成孔毒素，而是可以作为潜在的一种工具类药物，经改造后可以携带治疗药物在短时间内靶向性地到达哺乳动物脑和中枢神经系统，继而为脑和中枢神经系统疾病的治疗提供新的方向．结合国内外相关研究，对ETX细胞毒机制及致病机理进行了综和评述．     

D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化

复苏实验室保存的产气荚膜梭菌ε-pET28a(DE3)菌株,经限制性内切酶EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切鉴定后,诱导表达得到大量可溶性的ε重组毒素蛋白.对重组蛋白进行镍柱纯化,得到纯度高于95%的毒素蛋白,利用Western Blot和ELISA分析检测纯化后的毒素蛋白,显示该蛋白具有良好的特异性和免疫原性,为进一步研究单链抗体做铺垫.     

抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

改善肠内细菌丛的保健食品

据日本专利报导,肠内细菌丛与癌的发生有关。例如,大肠癌患者,肠內真菌增加;胃癌患者,梭菌属产气荚膜杆菌、链球菌、微球菌科、假单胞菌增加;直肠癌患者,肠内梭菌属产生的荚膜杆菌增加,乳酸菌     

浅谈水处理中的微生物应用新发现

本文介绍了目前水污染相关的几种微生物在水处理中的新的应用发现:一、采用产气荚膜梭菌作为指示菌来检测水中病原微生物,随着对它研究的深入,产气荚膜梭菌可能成为水污染的指标之一。二、在常温状态下通过投放生活状态的酵母菌能够消除水中的蓝藻污染,分析其可行性,并通过实验探究出酵母菌治理蓝藻污染的过程。     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

肠道菌群模式菌株的HPLC分离条件优化及其表征

采用高效液相色谱分别考察了肠道菌群模式菌株及各单菌的色谱行为,成功建立了HPLC分离分析肠道菌群模式菌株的最佳洗脱方法,即阶梯式梯度洗脱.结果显示,肠道模式混合菌株经过高效液相色谱分离得到5个明显的洗脱组分,分别为0.10 mol·L~(-1)(脆弱拟杆菌和金黄色葡萄球菌)、0.20 mol·L~(-1)(青春双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌)、0.25 mol·L~(-1)(粪肠球菌)、0.30 mol.L~(-1)(奇异变形杆菌、克雷伯肺炎杆菌和产气荚膜梭菌)和0.50 mol·L~(-1)(大肠杆菌和产气荚膜梭菌)洗脱峰.色谱柱的上样浓度为培养菌液(OD600=0.576)的5倍时,其最大上样量为500μL,且方法分辨率高、重现性好、结果稳定.     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了 8个含ScFv基因的表达质粒     

板栗抗性淀粉消化前后的益生作用及结构变化

制备与纯化得到了板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉,研究了它们的益生作用与结构变化.结果表明：板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉对双歧杆菌和乳酸杆菌都有显著的增殖作用,对大肠杆菌和产气荚膜梭菌有强抑制作用,对粪肠球菌、梭状杆菌、兼性细菌无明显影响;它们的发酵液总酸度增大,说明它们能被肠道益生菌发酵利用;板栗抗性淀粉经消化处理后比表面积增加,经发酵后比表面积更大.板栗抗性淀粉的平均聚合度较之原淀粉显著变小,发酵后板栗抗性淀粉或消化抗性淀粉的平均聚合度降低;板粟抗性淀粉的晶型为V型,经消化后转变为B型,板栗抗性淀粉及消化抗性淀粉经发酵后,晶型都转变为A型,微晶度、亚微晶度及总结晶度较之发酵前都明显降低.     

气性坏疽伴多重感染1例

产气荚膜杆菌是引起气性坏疽的主要病原菌,吉林市中心医院在一开放性骨折患者的脓汁和血液中同时各分离出1株产气荚膜杆菌,并伴肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的多重感染,现报告如下:     

马尾松毛虫毒素致病途径的初步探讨

本文报导用采自轻度马尾松毛虫病流行区的马尾松毛虫,取其毒毛胸段,捣碎制成无菌滤液,对小白鼠和家兔进行各种致病途径的研究.用0.1毫升滤液(约含一条松毛虫毒素量)分别给小白鼠作皮下、肌肉和腹腔注射,结果关节反应动物数依次为45.00％、26.32％和22.22％,并经病理学检查证实其病理反应与以往报导的经皮肤接触所致病变相同,表明注射途径同样可使实验动物发病.这将为进一步研究松毛虫病的致病机理和防治提供实验方法的依据.本实验还观察了用滤液灌胃和滴眼途径对小白鼠和家兔的致病作用,结果均未能引起实验动物发病,初步认为马尾松毛虫毒素经消化道和眼结合膜不产生致病作用.     

屎肠球菌JT1701对人体肠系细菌的调控作用

用屎肠球菌JT1701与人体肠系有害菌（大肠杆菌、产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌）和人体肠系益生菌（婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌）分别及共同培养发现,肠球球菌对这些菌均有抑制作用。它能抑制这些菌氨的产生,降低培养基的pH。其原因是,屎肠球菌与氨产生相关的尿酶、氨基酸脱氨酶的种类少,酶活性亦低,而与NH4^ 同化相关的谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合酶、谷酰氨合成酶的活性要高得多。表明屎肠球菌对人体肠系菌群具有调控作用。     

两种抗α毒素单链抗体基因的序列分析

应用RT－PCR技术,从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜酸菌α毒素单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株2E3和1A8中,分别扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser）3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因2E3－ScFv和1A8－ScFv,并将其克隆至pGEM-T载体中,经核苷酸序列分析证实,VH和VL基因以及Linker基因拼接正确,2E3－ScFv基因全长为729bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可燮区基因特征,2E3－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链kⅢ家簇;而1A8－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链кⅥ家簇。     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将2种抗A型产气英膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv）基因ScFv－2E3和ScFV-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOG21中,构建了重组质粒PUC2E3和pUC-1A8,pET20b-2E3和pET20b-1A9,pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-1A8,然后分别转化至大肠杆菌中,提取质粒,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段,说明已成功构建了8个含ScFv基因的表达质粒。     

甲基丙烯酸十六酯的合成及结构表征

研究了以α-甲基丙烯酸和十六醇为原料采用直接酯化法合成α-甲基丙烯酸十六酯的工艺条件,主要探讨了α-甲基丙烯酸与十六醇摩尔比、催化剂和阻聚剂的用量以及反应时间对酯化反应的影响，得出了合成的最佳条件：α-甲基丙烯酸与十六醇的摩尔比为1．2：1，对甲苯磺酸的质量分数为1．4％，对苯二酚的质量分数为0．4％，反应温度为110～120℃，反应时间为5h，酯化产率可达到95％以上．酯化产物经薄层色谱分析及红外光谱、核磁共振谱测定，证明所得产物为α-甲基丙烯酸十六酯．