△6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的△6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的△6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的△6-脂肪酸脱氢酶是所有△6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的△6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶处于真核类△6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的△6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的△6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向△5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的△6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类△6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的△6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

通过同源搜索分析线粒体蛋白转运系统的进化

基于酵母线粒体蛋白转运系统的35个亚基,作者通过同源查找的方法,在27个不同进化层次物种的蛋白组和基因组序列中搜索线粒体蛋白转运系统亚基的同源序列,利用序列之间的同源关系进而构建线粒体蛋白转运系统的进化史.结果显示,线粒体蛋白转运系统的35个亚基中有6个可以在原核物种中找到同源序列,显示了它们的原核起源;线粒体蛋白转运系统的核心亚基出现在真核生物进化早期;其他亚基在真核物种的不同进化分枝中表现出了多样性,并且可以看到一些物种特异性亚基.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

烟草质体分裂相关基因NtFtsZ cDNAs的克隆及功能分析

通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法从烟草中克隆了两个质体分裂相关基因NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2的cDNA.推导的氨基酸序列分析表明,两者均具有FtsZ蛋白的典型特征和GTP结合位点;N端氨基酸序列分析也表明,NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2都具有质体导肽特征,发现了在高等植物中至少存在两个具有质体导肽的FtsZ;基于氨基酸序列的分子谱系分析也支持这一结果.核酸杂交表明两者在植物的不同发育时期具有相似的表达谱.将这两个基因转入E.coli中表达,它们能影响宿主菌的正常分裂,初步验证了其功能.这些研究提示在高等植物中FtsZ可能具有更多样化的功能.     

无蹼壁虎6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从无蹼壁虎中获得了6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA片段序列.与铅山壁虎的同源基因序列相比,除CHD1-5'端序列中有3 bp的缺失外,其他基因序列均具有相同的核苷酸和氨基酸长度,且核苷酸序列和氨基酸序列的保守性均非常高(97%~100%).在与有鳞目、龟鳖目和鳄目的其他已知序列比较时,发现6个基因的8个片段有不同程度的同源性,其中GHR基因的同源性最低,与该基因片段在进化分析中较高的ω值(Ka/Ks)是一致的.性染色体连锁基因的克隆和染色体定位,将有助于进一步了解壁虎类甚至高等脊椎动物不同类型性染色体的起源和进化.     

达乌尔黄鼠白色脂肪组织中多不饱和脂肪酸合成基因表达

多不饱和脂肪酸对哺乳动物细胞膜的结构和功能、免疫能力、脂肪代谢等具有重要的调控作用。为研究其在冬眠动物体内合成受基因表达调控的情况,使用第2代转录组测序技术,对达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricuricus)的白色脂肪组织进行转录组测序,得到羟酰基辅酶A还原酶、烯酰辅酶A脱氢酶、Δ-5去饱和酶和Δ-6去饱和酶的碱基序列,并测得它们在起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期和冬眠期4个阶段的差异表达情况。结果显示:羟酰基辅酶A还原酶在冬眠期表达上调,与起始育肥期差异显著;烯酰辅酶A脱氢酶在冬眠期的表达量也显著高于起始育肥期和快速育肥期;Δ-5去饱和酶和Δ-6去饱和酶在起始育肥期高表达。表明达乌尔黄鼠体内多不饱和脂肪酸的合成存在着基因表达的调控,可能以此来实现在不同生理时期对细胞膜流动性和免疫能力的调节。     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

麻疯树P5CS基因的克隆及原核表达

使用RACE技术,从麻疯树叶片中克隆了Δ1吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,命名为JcP5CS. JcP5CS的cDNA全长2675 bp,包含一个2148 bp的开放阅读框,一个117 bp的5’-非翻译区以及一个410 bp的3’-非翻译区.开放阅读框编码716个氨基酸多肽链,分子量为77.54 kD,预测等电点为6.11.通过与其它物种的P5CS氨基酸序列比对,结果显示,与其他高等植物的P5CS氨基酸序列有很高的同源性.包含谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两个结构域以及ATP及NAD (P     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

水稻的4个NADP-ME基因具有不同的表达模式

在高等植物中,NADP-苹果酸酶(NADP-ME)由一个小的基因家族编码.根据发表的水稻基因组序列信息,对水稻的NADP-ME家族进行了研究.结果表明:水稻NADP-ME家族由3个胞质型NADP-ME和1个质体型NADP-ME构成,发现两个新的胞质型NADP-ME基因. 尽管4个水稻NADP-ME的氨基酸序列存在较高的相似性,但是其中一个胞质型NADP-ME(OscytME3)在NADP-ME氨基酸序列保守区存在着不同于其他NADP-ME的特征. 进化树分析表明它可能起源于不同于其他NADP-ME的另一条进化分支.虽然4个NADP-ME基因表达的组织特异性和发育阶段特异性不尽相同,但是在功能上可能都参与植物的胁迫应答.     

无脊椎动物进化中的模糊问题思考

无脊椎动物是动物界的低等类型、最庞大类群。本文根据古生物学、现代生物学和生物进化论研究成就，就无脊椎动物起源、三叶虫、头足类、昆虫进化过程中的模糊问题作了逻辑推理思考。     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

硫酯蛋白家族保守区域分析

硫酯蛋白家族(thioester-containing proteins,TEPs)广泛分布于动物界,在动物非特异性免疫反应中发挥了重要的作用,然而其家族成员多,分子进化关系复杂.本研究从基因数据库中挑取已收录TEPs家族各成员的氨基酸全序列,包括α2-巨球蛋白、补体3、补体4、murinoglobulins、卵巨球蛋白、妊娠区带蛋白,α-1-抑制因子等.多重序列比对分析TEPs家族各成员间功能位点和保守区域的变化,构建系统进化树分析TEPs家族分子进化.TEPs家族除保守的GC*EQ**硫酯键区域及两侧的脯氨酸残基,还有7个完全保守的氨基酸残基及G*****Q*T,FPETW,QTD,KPTVK等保守区域.上述分析结果可为深入研究TEPs家族分子进化及动物非特异性免疫进化提供参考.     

东北七鳃鳗Lm-PHB2的生物信息学分析及多克隆抗体制备

在首次获得七鳃鳗Lm-PHB2的全长cDNA序列的基础上,对预测得到的LmPHB2氨基酸序列进行了生物信息学和进化分析;经原核表达并大量提纯获得重组蛋白rLm-PHB2,在此基础上,优化兔抗七鳃鳗抗体的免疫制备流程.结果表明:七鳃鳗LmPHB2蛋白的理论分子质量约为33.25ku,理论等电点为9.85,为亲水性蛋白;信号肽预测结果表明其ORF区中无信号肽.该蛋白有1个位点可能发生N型糖基化,不存在棕榈酰化位点;跨膜区预测表明Lm-PHB2仅在内膜区域存在跨膜结构.系统发育树分析表明Lm-PHB2的进化地位在头索动物与脊椎动物之间,与物种进化规律基本一致.制备了效价≥64万且与重组蛋白rLm-PHB2和天然Lm-PHB2蛋白均有很强的特异性结合能力的多克隆抗体.Western Blot表明,Lm-PHB2蛋白在七鳃鳗的心、肾、肝和肠中均有表达,其中,在心脏组织中表达量最高.本实验为PHB2基因的进化研究提供了理论依据,并为七鳃鳗Lm-PHB2蛋白功能研究奠定了基础.     

肉鸭肝脏脂肪酸合成酶活性及脂肪酸合成途径的研究

利用放射线检测器和分光光度计,对肉鸭肝脏中参与脂肪酸合成的酶类:乙酰辅酶-A羧化酶,脂肪酸合成酶,NADP-苹果酸脱氢酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等酶的活性进行了测试分析.结果表明,肉鸭肝脏的各种脂肪酸代谢酶类的活性表现为:42日龄比21日龄的显著增加,显示随着日龄的增加,鸭肝脏合成脂肪的能力也显著增强.鸡的肝脏进行脂肪酸合成所必需的NADPH主要是由NADP-苹果酸脱氢酶参与的丙酮酸-苹果酸途径提供.与此相比,鸭的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性非常高,显示鸭的脂肪酸合成途径与鸡不同,脂肪酸的合成不仅仅有丙酮酸-苹果酸途径参与,戊糖磷酸循环也起到关键性的作用.     

近交培育五指山小型猪GHR基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的探讨近交培育五指山猪矮小的分子机理,为五指山猪实验动物化奠定基础。方法近交系五指山猪肝脏组织提取总RNA,然后RT-PCR成功扩增出GHR基因,克隆入pGEM-Teasy载体进行测序,并与正常猪GHR基因序列进行比对;然后经SalⅠ和XbaⅠ双酶切回收后与同样经过双酶切回收的pEGFP-C1真核表达载体连接,构建五指山猪GHR基因真核表达载体。结果测序结果表明:五指山猪GHR基因编码区包括639个氨基酸;经过酶切和测序验证五指山猪GHR基因真核表达载体构建成功。结论经序列比对后发现GHR信号肽编码区发生两处氨基酸替换,可能会影响到生长激素的胞内运输;生长激素受体胞内域编码区发生多处突变,并且导致相应氨基酸发生替换,可能会影响生长激素受体的下游信号转导。五指山猪GHR基因真核表达载体的成功构建为进一步研究GHR的功能和下游信号转导奠定了基础。