rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶（Lys-C）成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3＿PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT（二硫苏糖醇）,并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明：重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的...     

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).     

水稻蛋白质激酶CK2催化亚基的表达和活性测定

用RT-PCR的方法分离到了水稻蛋白质激酶CK2催化亚基（OsCK2α）的cDNA,通过大肠杆菌高效表达系统表达了OsCK2α,并利用亲合层析的方法纯化了重组蛋白质GST—OsCK2α．得到的大肠杆菌重组蛋白质GST—OsCK2α能够体外磷酸化CK2的常用底物酪蛋白,并且该磷酸化反应能够被CK2的特异性抑制剂肝素所抑制,研究表明重组CK2α具有典型的蛋白质激酶CK2的活性,为研究水稻CK2及其底物的功能奠定了基础．     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

重组蛋白Fpr3的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了从分子水平上进一步研究PPIase与PP1的相互作用,将构建好的pGEX-5X-1重组表达质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导后得到了可溶形式表达的融合蛋白.采用GST亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,并用Factor Xa对融合蛋白进行柱上酶切,SDSPAGE检测表明可获得较高纯度的GST-Fpr3融合蛋白以及去除GST标签的目的蛋白.用其免疫日本雄性大耳白兔,成功制备了抗GST-Fpr3的多克隆抗体,为Fpr3的空间结构的解析和相应的分子识别过程奠定了基础.     

重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

为了了解人过氧化氢酶在各种常见肿瘤细胞中的表达情况,构建人过氧化氢酶的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化人过氧化氢酶,并进行活性检测.我们通过常规分子克隆手段构建原核表达载体pET-15bhCAT,将其转化大肠杆菌Rosetta-gami,经过IPTG诱导,表达产物经超声破碎后用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化,用试剂盒检测重组hCAT酶活性,然后检测其对DNA氧化损伤的保护作用.通过荧光定量PCR(qPCR)测定hCAT基因在HLF-1正常细胞与几种常见肿瘤细胞中的表达情况.本研究成功构建了pET-15b-hCAT的原核表达载体,SDSPAGE检测结果表明,IPTG诱导表达出一条分子质量约为59.7 ku的目的蛋白,该蛋白主要以可溶的形式存在,活性检测表明经纯化得到的rhCAT比活力为62.9 U/mg,pUC19质粒氧化损伤保护实验显示rhCAT对DNA有一定的损伤保护作用.qPCR检测显示hCAT基因在U937、K562、PC3、HeLa、HT-1080、HepG-2等肿瘤细胞中的表达量明显低于HLF-1正常细胞.成功构建了人过氧化氢酶的原核表达载体,利用大肠杆菌Rosetta-gami获得了hCAT的可溶性表达,纯化的rhCAT具有活性,hCAT基因在U937、K562、PC3、HeLa、HT-1080、HepG-2等肿瘤细胞中的表达量明显低于HLF-1正常细胞.这为后续功能研究及性质实验奠定了基础.     

人纤溶酶原Kringle5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle5结构域的基因,并将其克隆至表达质粒pET25b( )中。重组载体pET25b（ ）/kringle5转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,在12kD处可见明显的表达条带,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在。包涵体经过体外变复性,SP-SepharoseFF离子交换柱一步纯化,15%SDS-PAGE鉴定考染一条带,纯度达95%以上。所得到的目标蛋白明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生。     

环亚酰胺水解酶在大肠杆菌中的重组表达与纯化

以重组质粒pEI为模板,PCR扩增环亚酰胺酶基因序列,插入pMAL-s表达载体中.重组质粒转入E.Coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导可溶性表达融合蛋白MBP-CIH,利用Amylose亲和柱一步纯化获得MBP-CIH,再经人鼻病毒3C蛋白酶切除亲和臂MBP,硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析获得电泳纯的CIH,纯化倍数为12.7,活力回收29%,比活为36.3 U/mg.重组环亚酰胺水解酶的最适pH为8.0～9.0,最适温度50 ℃,在温度低于55 ℃时酶的性质相对稳定.Ni2 、Co2 能显著提高酶活力,Mn2 、Ca2 和Mg2 对酶活没明显有影响,Cu2 、Zn2 、Cd2 、Fe2 以及金属螯合剂8-羟基喹啉、EDTA则对酶有不同程度的抑制作用.初步说明该酶是一个金属依赖性酶.     

hIL-10在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

构建了含有人白细胞介素-hIL-10（Human Interleukin10,hIL-10）基因的重组质粒,在大肠杆菌中的高效表达,并对其生物学活性进行了鉴定．用RT-PCR扩增hIL-10 cDNA,并插入原核表达载体PET-32b．将重组质粒转入BL21（DE3）感受态细胞,在37℃用IPTG诱导hIL-10表达．表达的重组蛋白经复性纯化后,用夹心ELISA法检测其对外周血单核细胞（PBMC）合成IFN-γ的抑制作用．重组质粒PET-32b／hIL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列和文献报道的hIL-10 cDNA序列一致．SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000．活性测定结果显示,重组蛋白能显著抑制PBMC合成IFN-γ．这表明构建的PET-32b／hIL-10可以在大肠杆菌中高效表达,经复性和纯化后,获得了具有高纯度和活性的hIL-10     

重组人附睾特异蛋白BDFx的优化表达与纯化

通过改变异丙醇-β-D硫代半乳糖苷诱导浓度、诱导温度及诱导培养时间,优化含重组人附睾特异蛋白BDFx工程菌的表达条件．运用DEAE阴离子与CM阳离子交换层析及S-100分子筛层析纯化重组蛋白,用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描等方法鉴定目的蛋白．结果显示,缩短诱导培养时间、降低IPTG浓度等可提高重组蛋白的表达量,表明适当提高诱导表达温度不会形成包涵体,并可缩短表达时间．     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

重组人SOD2／3杂合酶的制备及其生物活性初探

为获得重组SOD2／3杂合酶,以及观察SOD2／3能否转导入宫颈癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,构建了原核表达载体pET—SOD2／3,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达获得N端带有6个组氨酸标签的sOD2／3杂合酶;用Ni柱金属螯合亲和层析纯化重组SOD2／3;利用肝素柱层析验证SOD2／3的肝素靶向性;将...     

人胰蛋白酶原-2在大肠杆菌中的表达、纯化与活性测定

胰蛋白酶原-2是急性胰腺炎相关的敏感而特异的标志物,并且与多种肿瘤转移的过程密切相关．对胰蛋白酶原-2基因5’端4个氨基酸的密码子碱基进行简并突变,并在其3’端连接6个组氨酸编码序列构建含重组质粒pBVTg2的大肠杆菌工程菌-pBvTg2／DH5α．重组大肠杆菌经温度诱导后获得了高效表达,重组蛋白占总菌体蛋白的20％,并以包涵体形式存在．包涵体经尿素缓冲液裂解后,通过Ni-NTA亲和树脂一步分离纯化．纯化蛋白经SDS-PAGE分析及利用anti—histidine mAb进行Western blotting分析,以及蛋白N末端测序分析,结果表明与目的蛋白特征相符合．纯化的重组人胰蛋白酶原-2经复性后能与天然人胰蛋白酶原-2的单抗antihTrypsinogen2 mAb特异结合,复性后的蛋白在肠激酶作用后测得具有74BAEEU／mg的胰蛋白酶比活力,为进行胰蛋白酶原-2单克隆抗体的制备及其检测和应用奠定了基础．     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b( )构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。     

人穿孔素羧基端肽段的表达纯化与活性鉴定

穿孔素,即成孔蛋白（pore forming protein,PFP),其溶细胞作用与免疫调节和自身免疫病以及其它多种疾病过程中的免疫性病理损伤相关。为得到足够量的PFP建立与之相关的免疫学研究手段用于基础和临床研究,在已克隆人PFP cDNA的基础上,用基因工程方法表达了人PFP C端124个氨基酸肽段（hPFP-C),并通过谷胱甘肽琼脂糖新和层析获得纯化的GST/hPFP-C融合蛋白,经凝血酶酶切和再次北极和层析去除GST部分,得到了纯化的hPFP-C蛋白。纯化的hPFP-C蛋白与兔红细胞共育,呈现钙依赖的溶血活性。