抗艾滋病病毒蛋白CVNH在大肠杆菌中表达条件的优化

CVNH(Cyanovirin-N homology)蛋白家族是具有抗HIV活性的蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)的同源物。在前期研究中,已首次获得水蕨Ceratopteris thalictroides CVNH基因的全长序列,构建了pET32a-CtCVNH的原核表达载体。以此为基础,对CVNH在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中的表达条件进行优化。分别探讨了最佳培养基类型及成分、培养基初始pH、诱导时机、诱导剂浓度及诱导时间。优化后的诱导条件是:含24 g.L-1酵母提取物和72 g.L-1胰蛋白胨的TB培养基、培养基初始pH为8.0、菌液A600nm为0.6时加入1.6 g.L-1乳糖诱导6 h。CVNH蛋白的表达量较优化前提高了1.9倍。这为进一步开展CVNH的药物研制和开发奠定基础。     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

鸡致病性E.coli O24基因工程包涵体疫苗的制备及免疫原性

利用已构建的基因工程菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分别可见表达的20ku和40.9ku的特异条带,确定蛋白以包涵体的形式存在.Western blot结果表明,表达的Ⅰ型菌毛蛋白(pilA基因编码)和外膜蛋白(ompC基因编码)可与抗体发生特异性结合,说明其具有良好的反应原性.将表达特异蛋白的重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC分别制成基因工程包涵体疫苗,免疫小鼠后,具有很好的保护能力.ELISA结果显示,免疫的小鼠体内已产生相应的抗体,效价为1∶400,说明这2种疫苗有很好的免疫原性.表明这2株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

重组人B淋巴细胞刺激因子原核表达条件的优化

以重组人B淋巴细胞刺激因子(rhBLyS)蛋白表达宿主菌株M15(pQE30a／rhBLyS)作为研究对象，借助SDS-PAGE分析方法，对于用IPTG诱导的重组目的产物的表达进行了优化研究。分析比较了pH值、裂解液种类、诱导时问、IPTG浓度、温度等参数对重组产物表达的影响．实验结果表明，降低温度和IPTG浓度有利于增加靶蛋白的可溶性，27℃和0．075mol／L IPTG为比较适合的表达条件．     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。     

贻贝蛋白Mgfp-5的原核表达与纯化

贻贝(Mytilus galloprovincialis)足丝中黏附蛋白,是一种黏合强度高、生物相容性好、优质的生物黏合剂,可以应用于医学、表面化学、海洋工程等领域,其中富含DOPA(多巴,3,4-二羟基苯丙氨酸)的贻贝足丝蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5,Mgfp-5)显著表现出此特性。天然获取Mgfp-5含量低,易固化,纯化困难,越来越多学者尝试基因工程获得黏蛋白。文中构建重组质粒p ET28a-mgfp,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白Mgfp-5。为得到高质量的Mgfp-5蛋白,优化了Mgfp-5蛋白诱导表达参数:菌液OD_(600)=0.8,诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷(IPTG)0.8 mmol/L,37℃,诱导8h;优化镍离子亲和层析纯化蛋白Mgfp-5最佳条件为:Elution Buffer的p H为7.0,500 mmol/L咪唑。Western Blot鉴定到重组Mgfp-5可以特异性表达。该研究为得到大量Mgfp-5蛋白奠定了基础,为加速黏蛋白的黏附机理及生物医学黏合剂的开发提供参考。     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

禽致病性大肠杆菌研究进展

从大肠杆菌的危害性、毒力因子和致病机理等方面对国内外关于禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的研究进行了综述。APEC的血清型众多,尤以O1,O2和O78最为常见,可引起鸡、火鸡等其他禽类的气囊炎、肝周炎、心包炎、败血症等其他肠道外疾病,给养禽业带来严重威胁和造成重大经济损失。     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

禽流感及人感染高致病性禽流感的危害和防治措施

阐述了禽流感病毒的特点及其流行病学特征,着重介绍了人感染高致病性禽流感的致病机制、治疗措施和预防的方法。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。