利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响

为了探究真核细胞中蛋白激酶CDK1的磷酸化修饰对驱动蛋白分子Kif18A的ATP酶活性的影响,利用昆虫杆状病毒表达系统,在体外表达并纯化Kif18A模拟磷酸化(EE)和非磷酸化(AA)的突变体蛋白(Kif18A-EE,Kif18A-AA).首先构建驱动蛋白Kif18A的杆状病毒表达载体质粒pFast-Bac-FLAG-Kif18A-AA或EE,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆.随后提取杆状病毒基因组,转染昆虫细胞SF9后得到能够表达FLAG-Kif18A突变体蛋白的杆状病毒.扩增病毒后,对病毒感染SF9细胞表达目的蛋白的条件进行优化,最终通过蛋白纯化得到有活性的Kif18A突变体蛋白,并在体外检测纯化蛋白的ATP酶活性.结果显示,Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白.这一结果表明,CDK1的磷酸化修饰能够降低驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性.     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

人尿激酶原纤原受体识别区嵌合突变体的构建与表达

采用同源转座方法,构建了在尿激酶原K区138～139位点插入了赖氨酸甘氨酸天冬氨酸(KGD)序列的2种尿激酶原嵌合体基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),并以昆虫细胞SF9为宿主获得了高效表达,表达量在33.34 μkat·mL-1, 细胞密度为106·mL-1,表达高峰期表达产物占细胞总蛋白的15%以上.表达产物展示出较高的纤溶活性,并具有良好的人尿激酶原免疫原性,同时,经SDS-PAGE试验检测,昆虫细胞分泌的突变体相对分子质量符合理论预期,为5.4×104,绝大多数为单链态形式.经过离子交换、分子筛层析及超滤浓缩等步骤对突变体蛋白进行了初步纯化,光浊度法试验表明含有KGDW序列的尿激酶原突变体具有较强的血小板聚集抑制活性,而含有KGDS序列的突变体几乎不具有任何活性,表明羧基端边侧序列对KGD展示正常的受体结合活性影响较大.溶解圈试验表明2种突变体均保留了较高的纤溶活性,说明插入序列不影响尿激酶原的酶切活性.     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白，并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒，提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后，用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达MVM VP2重组蛋白，经Western blot和IFA检测分析，重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性，为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌－杆状病毒穿梭系统将一套含有绿色荧光蛋白基因和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地殂多角体。     

人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红活性研究

以肌红蛋白(Mb)为骨架构建并纯化了三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb,双突变体蛋白F43Y/F138W Mb及单突变体蛋白 F43Y Mb,并对三个突变体蛋白的苋菜红(amaranth)脱色降解活性进行了研究。催化活性及酶动力学研究结果显示,相比于F43Y/F138W Mb和F43Y Mb,三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的苋菜红催化效率最高,这表明色氨酸对人工脱色过氧化物酶的活性起了重要作用。该研究不仅为今后的血红素蛋白设计提供了理论依据,同时也表明人工酶在染料废水处理方面具有潜在的应用价值。     

点突变对枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶结构和功能的影响

目的研究定点突变对枯草芽孢杆菌B23所产生的甘露聚糖酶活性及蛋白结构的影响,深入了解该酶结构与功能间的关系,为其分子改造提供理论依据。方法通过与同源酶蛋白序列的比较和分析,在同源性较高的色氨酸第196、198和199位点上,天冬氨酸第91位点上和谷氨酸第191位点上通过特异引物引入突变,PCR扩增获得甘露聚糖酶的突变基因,B.subtilis WB800为表达载体,纯化相应的诱变蛋白,测定其酶活性及荧光光谱变化。结果三个色氨酸突变体蛋白[Man(W196H)、Man(W198H)、Man(W199H)和Man(W199A)]核的活性均有所下降,其中Man(W199H)突变体酶活力几乎丧失,为突变前的4%。Man(D91N)和Man(E191Q)的酶活力也分别降至突变前的10%和12%。结论W199、D91和E191是酶活性的必需基团,对其造成的突变对甘露聚糖酶的结构和活性有显著影响。     

论南宋发展的三种新式筒形火器

火药和火器均发明于中国,然而10世纪中国所制早期火药硝石含量低,且制成膏状,不能成为发射剂,因此早期火器借手动机械力发射。11-12世纪南宋成功制成高硝固体火药,并首次用于制造小型烟火。宋金交战时,固体火药和烟火用于改进老式火器,结果南宋初出现某些新型火器,如1128年制造的铳炮、1138年制出的火枪或喷火枪,是后来一切筒形火器的祖先。作为铳炮和火枪的杂交产物,1259年突火枪出现。这三种武器的出现引起南宋以来火器史中的第二次技术革命,具有重大意义和深远影响。     

《尔雅·释言》“骓”字考

传统注疏多将"菼,骓也"释读为用实体特征解释实体本身,即以"白色"义训释菼类植物。这种释读过于牵强,通过推断"骓、鵻、萑、蓷"几个字之间的关系,认为这个词条应为"菼,鵻也"。同时,《尔雅》编纂者在编辑这一词条时,混淆了"萑"字所记录的"菼类植物"、"益母草"两个词,训释错误。     

MBEKHTA''''S子空间与CI算子

利用两个子空间H0(A)和K(A)取代了传统的N(A)和R(A),给出一个有界线性算子A是CI算子的两个充分条件和三个判定条件,同时借助于这些结果及CI算子的定义来判断一些常见的有界线性算子是不是CI算子。     

"仁、义、礼、智、信"乃构建和谐社会之精髓

坚持科学发展观与构建和谐社会的目标并行不悖;无论是物质生产还是精神生产,都不能违背自然或社会发展过程的一般规律。原始儒家尤其是其创始人孔子于《论语》中所提及的学术思想,至今仍然有着建构社会和谐秩序的实践意蕴。这对于增强民族文化的凝聚力有着明显的作用。     

N-异丙基丙烯酰胺共聚和互穿聚合物网络温敏凝胶的溶胀与释药性能

制备了不同配比的P(NIPAm-co-AAm)共聚水凝胶和PAAc/P(NIPAm-co-AAm)互穿聚合物网络(IPN)水凝胶,研究了其溶胀与释药性能.结果表明:该共聚水凝胶具有热缩温敏性,而该IPN水凝胶具有热胀温敏性.随AAm含量的增加,该共聚水凝胶溶胀比减小,温敏性减弱,释药率减小;与此相反,随AAm含量的增加,该IPN水凝胶溶胀比增大,温敏性增强,释药率增大.     

Microbial desulfurization of fuel oil

Culture conditions of desulfurization microbes were investigated with a bioreactor controlled by computer.Factors such as pH, choice of carbon source, optimal concentrations of carbon, nitrogen and sulfur sources were determined. The addition of carbon in a culture with a constant pH greatly improved the growth of Rhodococcus. Cells and cell debris from microbes rested using a sulfur- specific pathway were used to desulfurize diesel oil treated by hydrodesulfurization (acquired from the Research Institute of Fushun Petroleum with total sulfur level at 205 μg/mL).Strains 1awq, IG, X7B, ZT, ZCR, and a mixture of No. 5 and No. 6, were used in the biodesulfurization process. The reduction of total sulfur was between 10.6% and 90.3%.     

Pathway-based analysis for genome-wide association studies of schizophrenia to provide new insight in schizophrenia study

Schizophrenia (SZ) is an inheritable complex mental disease. There have been several genome-wide association studies (GWASs) of SZ to identify novel genetic susceptibility factors. To further interpret SZ GWASs, pathway-based analysis (PBA), which considers the combined effect of variants and identifies pathways associated with traits, provides a feasible solution to discover the biological function and mechanism of SZ. Furthermore, to investigate the common pathways between SZ and bipolar disorder (BD) wil...     

半胱胺对鹅生长内分泌的影响

探讨了半胱胺(CS)对成年鹅血浆中生长抑素(SS)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的影响和调节机理.14只装有翅静脉瘘管的成年杂交鹅(川白×太湖),自身对照.试验期于日粮中一次性添喂半胱胺(100mg/kg,按体重计),自由采食和饮水.采取对照期和处理后第1、3、5、7d的血样,用RIA双抗法测定其中激素的含量.结果表明,试验期SS较对照期(1.89±0.10)μg/L分别降低了41.18%(P<0.01)、26.74%(P<0.01)、37.43%(P<0.01)和17.11%(P<0.05);试验期第1、3、5和7d的GH较对照期(0.55±0.15)μg/L显著(P<0.01)升高,分别为34.55%、78.18%、65.45%和54.55%;试验期的IGF-I较对照期(25.29±4.91)μg/L分别升高了7.28%、59.07%(P<0.01)、22.41%(P<0.05)和1.38%.因此,CS能够降低成年鹅血液中SS含量,使GH和IGF-I水平升高,从而调节鹅的神经内分泌,促进生长.     

增强型全速率语音编码的原理及实现

在无线通信系统中，语音压缩编码起着非常重要的作用，因为它在很大程度上决定着合成话音的质量和系统容量。为了提高话音质量，GSM提出了增强型全速率（EFR）语音编码方案。它在LPC声码器的基础上，采用了A－B，S和VQ等技术，编码信息中既包含若干语音特征参量又包括部分波形编码信息。因此，能提供高质量的编码，且比特速率压缩到12.2kbps,为TD－SCDMA移动通令系统提供了一咎可行的语音编码方式。笔者从语音编码的基本概念出发，详细地介绍了EFR语音编码的原理及代数码本搜索实现技术。     

多数据通道高速互连背板平台的设计和实现

为了给软件无线电的研究提供一个测试平台，设计实现了一个多数据通道高速互连背板平台．背板平台包括传输母板、时钟分配板和数据通道交换板，并提供ADC，DDC，DSP，DUC和DAC单板接口．通过采用高性能芯片和合理的高速设计方法，实现了背板平台良好的传输误码率和时钟晃动性能以及多个数据通道的自定义总线形式．