直接注射DNA治疗技术

现在,实验医学已进入基因治疗阶段,但是要找到合适的基因物质却没有那样简单。最常用的方法是在基因上“加载”病毒,使病毒“悄悄走近”指定的细胞。不久前美国威斯康星州立大学研究人员研制成一种更简单的方法直接往肌肉组织细胞中注射脱氧核糖核酸(DNA)。约翰·沃尔夫及其同事往老鼠肌肉中注入含有被他称为“纯DNA”的营养液,希望细胞能排斥外来的DNA,但是事与愿违,细胞却从中接受了储存在DNA中的全部信息。这使研究人员得到启示,这结果     

腺相关病毒外壳修饰与肿瘤靶向治疗

靶向性是肿瘤基因治疗取得成功的关键因素. 在众多基因治疗病毒载体中, 腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前广为关注的基因治疗载体系统. AAV具有广泛的宿主范围, 这也导致其缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高. 因此, 提高AAV载体在体内运输的靶向性和感染目的细胞的效率, 是实现AAV基因治疗的关键. 迄今为止, 科学家已开发出很多策略来改造腺相关病毒的外壳, 期望增强其靶向性或重靶向目的细胞. 这些策略不仅包括传统的化学修饰、噬菌体展示、外壳基因组改造和嵌合载体, 也包括新颖的标记营救、衣壳蛋白定向进化、AAV外壳直接肽段展示和AAVP (AAV-Phage)等. 本文评述了对AAV外壳改造达到靶向肿瘤细胞的研究进展.     

基因治疗——病笃投医

去年许多人曾预言,在1985年年底前将作基因治疗的临床试验。可是,基因治疗学家却遭到挫折,问题出在转移基因的反转录病毒的生物学。本刊本期刊登的霍克(Hock)和束勒(Miller)的论文对发展人类基因治疗的反转录病毒载体作出了进展,但却表明基因治疗依然渺茫(注1)。该文报道抗药基因转入了人体骨髓细胞。其重要性在于这是第一次在没有感染性辅助病毒存在的条件下成功地转移了基因;而且抗药基因在被转染的细胞中表达。独具匠心地设计和构建了这种反转录病毒载体,但在技术上还有些什么问题,投入应用的前景又如何呢?     

利用EBV穿梭质粒表达人凝血Ⅸ因子的初步研究

目前开展的遗传病基因治疗研究大多是先取患者体细胞体外培养,通过反转录病毒感染使正常基因cDNA整合于基因组中,选择克隆、扩增,再将细胞植回病人体内.但有以下问题:(1)细胞表达水平的高低很大程度取决于基因的整合位置,各克隆的表达相差悬殊,虽可通过挑克隆解决这一问题,但挑克隆工作量大,且克隆细胞如传代次数过多亦不利于其表达.(2)病毒载体通常只带一份拷贝进入细胞,转基因产物的表达量不高,这样植回病人体内的细胞就需     

人类巨细胞病毒启动子控制的人Ⅸ因子cDNA在人体细胞中的高效表达

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝系统的重要成分之一,它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B.在血友病B基因治疗的研究中,如何提高Ⅸ因子蛋白的产量是关键问题之一。在以前的研究中,我们比较了SV40早期启动子、小鼠金属硫基因蛋白启动子和Moloney小鼠白血病病毒LTR启动子的作用。为进一步提高Ⅸ因子基因在培养细胞特别是人     

外源性p53基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响

p53基因在细胞增殖调控过程中起重要作用,正常p53基因可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复,或启动细胞凋亡程序清除受损细胞,若p53基因缺失或突变,损伤后的细胞便会发生恶性增殖而形成肿瘤.约50%的人类肿瘤均有p53基因的异常改变.其中结直肠癌、肺癌、乳腺癌等常见肿瘤中p53基因的突变频率达50%～70%以上.基于这一原理,将野生型p53基因导入肿瘤细胞成为肿瘤基因治疗的策略之一.我国是胃癌高发区,胃癌发病率、死亡率在各类恶性肿瘤中均位居前列.因此,阐明胃癌发生发展过程中基因变异规律,探索胃癌治疗的有效方法,成为肿瘤研究的当务之急.研究表明胃癌中有较高频率p53基因缺失及突变,认为p53基因异常与胃癌发生、发展有重要关系.本项研究即是采用p53基因体外转染有缺陷的人胃癌细胞系,得到生长及致瘤性均有部分抑制的细胞,以探索采用p53基因治疗胃癌的可行性.1 材料与方法1.1 细胞培养及p53基因鉴定细胞:人胃癌BGC823细胞为北京医科大学附属人民医院建立,培养在含10%小牛血清的DMEM培养基中.染色体G带分析及荧光染色体原位杂交(FISH)显示有17号染色体部分缺失,Northern杂交分析也表明该细胞有p53基因表达水平下调.1.2 DNA转染通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p5     

腺相关病毒载体的靶向策略探讨

与其他病毒载体相比, 腺相关病毒(adenovirus-associated virus, AAV)由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一. 然而, 在临床基因治疗过程中, AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高, 同时也缺乏安全性. 因此, 提高重组AAV (rAAV)的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键. 目前, 各种不同血清型AAVs的分离、鉴定、应用以及rAAV制备技术的发展使得rAAV载体可用于更多的临床基因治疗实验. 而且, 当前针对rAAV载体各种靶向策略的研究也显示了很好的基因治疗应用前景. 这些靶向策略主要包括转录靶向、受体靶向、共价偶联靶向、各种不同血清型AAV的应用以及基因重组靶向策略等. 本文就近年来基于rAAV载体的各种靶向策略的进展作一评述.     

中国血友病B生物基因治疗研究状况

血友病B为一种严格的X连锁隐性遗传病, 由于其单纯的分子遗传基础和明确的临床表现, 容易观察疾病治疗的效果; hFⅨ较小的基因规模可以适用于几乎所有的常用基因载体系统. 在多种细胞均可以获得有效的表达使得基因治疗时可以有广泛的细胞选择范围, 同时也为生物工程制备重组蛋白药物提供了便利. 而且, 血友病B有天然和基因操作形成的动物模型便于治疗的临床前实验研究. 基于上述理由, 血友病B一直是遗传病基因生物治疗和重组蛋白药物制备的重要模型. 我国在20世纪90年代成功完成了基因治疗血友病B的临床试验, 对推进我国的基因治疗起到重要作用. 本文简述我国在血友病B的生物基因治疗方面的研究情况与发展方向, 希望为基因治疗和重组蛋白药物研究人员提供参考.     

重组逆转录病毒介导的人组织型纤溶酶原激活剂基因转移及在哺乳动物细胞中的持续表达

心脑血管疾病是全球发病率和死亡率最高的疾病,其中血栓性疾病危害最大,近年来迅速崛起的基因治疗为这类疾病的有效防治带来了希望。人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是目前晕为有效的溶栓药物之一,其缺点是价格昂贵、半寿期短,而血栓性疾病住住需要长期给药,故难以推广使用。如果将t-PA基因导入体细胞持续表达具有纤溶活性的产物供机体利用,可望达到防治血栓性疾病的远期效果。重组逆转录病毒载体已成功地用子多种疾病的基因治疗。为了探索这一途径治疗血栓性疾病的可行性,本研究首先用含有t-PA基因的重组逆转录病毒感染体外培养的哺乳动物细胞,然后对感染细胞纤溶活性的变化进行了长期观察。     

基因疗法可望走出困境——斯坦福大学人类基因疗法计划主任马克·凯访谈录

从最近几个月的研究趋势看,基因治疗领域似乎正在走出困境,一条光明的坦途已初现端倪.随着基因疗法成功的报道不断涌现,斯坦福大学医学院的人类基因疗法计划主任、美国基因和细胞疗法学会创始人之一的马克·凯(Hark Kay,下图)认为:"目前在基因疗法领域内出现的一些现象是非常喜人的".     

基因治疗

基因治疗,是指用基因治病,就是把功能基因导入病人体内使之表达,并因基因的表达产物———蛋白质发挥了功能使疾病得以治疗。它的基本原理来源于人类对自身遗传机制的了解。基因作为机体内的遗传单位,不仅可以决定我们的相貌、高矮,而且它的异常将会不可避免地导致各种疾病。基因治疗的提出最初是针对单基因缺陷的遗传疾病,目的在于用一个正常的基因来代替缺陷基因或者来补救缺陷基因的致病因素。1990年,美国国立卫生研究院用ADA(腺苷酸脱氨酶)基因,治愈一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁女孩,致使世界各国都掀起了研究基因治疗…     

非病毒基因载体介导短发夹RNA转染抑制肿瘤细胞生长

利用肿瘤细胞表面抗原G250的单克隆抗体G250mAb和聚乙二醇(PEG)修饰非病毒基因载体聚乙烯亚胺(PEI), 获得肿瘤靶向基因载体G250mAb-PEI-PEG. 该载体对HeLa细胞的基因转染效率达到70%, 远远高于对非肿瘤细胞NIH3T3 30%的转染效率. 通过该基因载体将Nucleostemin(NS)基因的特异性短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)高效率地转入靶细胞HeLa, RNA干扰下调了细胞中NS的表达, 显著抑制了HeLa细胞的增殖能力, 引起HeLa细胞凋亡, 而对NIH 3T3细胞的增殖和活性没有显著影响. 研究结果表明, 非病毒基因载体G250mAb-PEI-PEG可靶向性、高效率的转染HeLa细胞, 应用于基因治疗, 这对于宫颈癌的临床治疗具有重要的意义.     

癌症导向基因治疗新进展

近年来癌症基因治疗研究得到迅速发展.目前全世界已批准了l00多个癌症基因治疗的临床试验.而导向治疗已成为癌症基因治疗的重要发展方向.所谓导向治疗,是将高度选择性的基因转移与高度特异性的基因表达,或专一性基因产物活性及特异性药物活化相结合,从而将治疗基因定向转移至肿瘤部位并在肿瘤微环境中调节其表达,最终达到特异性地杀伤肿瘤细胞而又不损伤正常组织的目的.本文介绍了癌症导向基因治疗的重要进展.     

用多聚酶链式反应快速检测转化细胞中外源人凝血因子重Ⅸ cDNA

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用人工合成的寡聚核苷酸引物和DNA多聚酶进行体外DNA扩增,这是近年迅速发展起来的分子生物学技术。这一技术已在基因诊断、突变检测、多态性研究和核苷酸顺序分析等方面得到应用。在基因转移和基因治疗中,常常有必要对转化细胞进行DNA分析,检测区分外源DNA和基因组DNA。常规用的方法不仅需要大量细胞,而且需要同位素标记的探针和Southern杂交,整个过程既麻烦又费时。本文介绍我们用PCR技术,对转有外源基因——人凝血因子IX cDNA的血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞和其他转化细胞进行的直接检测和DNA分析。     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

多重耐药基因(MDR1)反义RNA对肺癌细胞耐药的逆转作用

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高,而且死亡率很高.肺癌患者约有50%可以手术治疗,另外50%患者由于转移等原因不能手术而需化疗等治疗,此外经过手术治疗的患者也常需化疗,然而许多患者常化疗失败(无效或效果不佳),非小细胞肺癌(NSCLC)对化疗尤其不敏感.研究已经表明,肿瘤化疗失败的重要原因之一是肿瘤产生耐药性,而耐药性的产生大部分由于多重耐药基因(MDR1)及其产物P-糖蛋白(Pgp)的表达增高,因此许多专家建议在化疗之前进行MDR1检查,以确定治疗方案,因此克服肿瘤耐药性是肿瘤治疗中急需解决的问题.反义技术是一种抑制基因表达的新技术,在抗病毒和抗肿瘤方面的研究结果令人鼓舞,显示了其在基因治疗方面的广阔应用前景.我们在体外用阿霉素诱导了一株肺腺癌细胞系的耐药株(GAOK),其MDR1基因表达增高.为了逆转GAOK细胞的耐药性,通过逆转录病毒介导的基因转移,将MDR1反义RNA导入耐药GAOK细胞     

英国为基因治疗开绿灯

今年元月十六日英国政府的健康部门发布了一份等待已久的报告,肯定了体细胞基因治疗没有严重的道德异议。这份来自由S·C·克洛西尔(S.C.Clothier)律师主持的一个独立委员会的报告,为英国研究部门计划基因治疗试验开绿灯,并使欧洲对体细胞基因操纵引起的道德问题不比围绕器官移植那么困难的舆论更加高涨。这份报告也正逢上基因治疗的研究革新,这种革新起始于美国,后扩展到欧洲。荷兰学者D·瓦莱因(D.Valerio)首先克隆的腺苷脱氨酶(ADA),在1993年领先使用于美国马里兰国家健康研究所F·安迪生(F.Anderson)M·布莱兹和(M.Blaese)的基因治疗试验。瓦莱因工作于荷兰应用研究组织的应用放射生物     

腺病毒E1和E4区基因共存的细胞系的建立

腺病毒载体相对安全,能有效地将外源基因转导到培养细胞或动物细胞中,但仍存在装载容量不够理想和免疫原性两个缺点.尤其是后一缺点,已成为制约其应用于临床基因治疗的主要因素.据认为,E4区基因在免疫原性中起着关键作用.因此人们希望通过发展E4区和Ela共缺陷的腺病毒载体,以降低或消除腺病毒载体免疫原性.这首先需要建立E4和E1区共存的包装细胞系,以互补腺病毒载体上E4和E1区功能的缺失,完成腺病毒载体的复制和包装.但有文献认为E4区和E1a不能稳定地存在于同一细胞中.我们成功地将腺病毒的E4区(pJM17的9724bp EcoRⅠ—XbaⅠ片段)插入AAV(Adeno-associated virus,腺辅助病毒)载体pAAV/neo中,并转导进293细胞(来自腺病毒E1区转化的人胚肾细胞,含有E1a区)中,得到了E1和E4区稳定共存的G418抗性细胞系.结果说明,E1和E4区可以稳定地共存于同一细胞,有可能建立无或低免疫原性,外源基因装载量由8kb扩大到17kb的新一代腺病毒载体系统.另外也表明,AAV载体介导的外源基因大小至少可达12kb左右(E4区9.7kb neo基因2.7kb=12.4kb).     

基因转移的发展及其应用

把遗传物质从一个细胞转入另一个细胞,大大推动了动物遗传学和基因表达调控的研究。这种遗传物质的转移最初是通过细胞融合来实现的,然而细胞融合只能把两套遗传物质合并起来,却不能有选择地把特定的基因转入细胞中。基因转移技术的出现则满足了这一目的。目前基因转移已广泛应用于基因的表达、基因的结构与功能、基因的分离、基因治疗及生物品种的改良等许多领域,并在这些领域的研究中取得了     

Ti质粒基因在单子叶植物朱顶兰和吊兰中的表达

致瘤农杆菌感染创伤的双子叶植物后,由于创伤激活了细胞体内的特异性信号分子,诱导Ti质粒毒性基因(vir)的调节和转移DNA(T-DNA)中间物的产生,从而使T-DNA转移到植物细胞之中。T-DNA中致瘤基因(onc)的表达导致冠瘿瘤的形成;胭脂碱合成酶基因(nos)或章鱼碱合成酶基因(oct)表达产生胭脂碱(nopaline)或章鱼碱(octopine)。这类胍基衍生物(opine)的检测就能为T-DNA是否在植物细胞中表达提供了直接的证据。因此,人们能够以nos或oct为标记基因利用农杆菌的Ti质粒作为植物基因工程载体,从