泛素特异性蛋白酶2a的表达及催化机制

研究USP2a在肿瘤发生发展中的催化机制,设计引物对USP2a的关键氨基酸残基Asn218,Cys223,His464和Asn482进行点突变,分析突变后对USP2a催化活性以及底物特异性的影响。利用荧光检测方法测定USP2a-WT和USP2a-Ms的酶促动力常数,并采用LC-MS/MS与SDS-PAGE方法分析USP2a-WT和USP2a-Ms的异肽酶活性,获得了可溶性表达的USP2a-WT和USP2a-Ms重组蛋白。结果表明,氨基酸残基Cys223和His464突变后酶失去活性,其余突变体分解底物Ub-AMC的催化效率与野生型无显著差异,氨基酸残基Asn218和Asn482单独突变后对酶活性没有显著影响,但双突变体USP2a-N218A/D482A则显著降低酶活性。USP2a的氨基酸残基Cys223和His464直接参与酶的催化反应;氨基酸残基Asn218和Asn482可能通过形成Asn218-Asn482电子对在催化过程中起到稳定氨基酸残基His464的作用。     

豆豉纤溶酶纤溶活性的定向进化研究

通过易错PCR方法向来源于枯草芽孢杆菌DC-12的豆豉纤溶酶基因中引入突变并构建突变体库.利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA以酶活力为指标对突变体库进行筛选,通过三轮易错PCR最终获得一株酶活力提高的突变株M324.序列分析表明突变体M324酶基因发生了六处碱基突变,其中四处突变发生氨基酸取代,另两处为无义突变.通过SWISS-MODEL Repository模拟突变酶的结构显示,三个突变氨基酸位于回环结构上,一个位于α螺旋上.纤维蛋白平板法测定纤溶酶活,结果显示突变酶的比活力是野生型的2.44倍.     

用点突变方法研究海参精氨酸激酶的活性位点

为研究动物能量代谢,用点突变的方法从双亚基海参(Stichopusjaponicus)精氨酸激酶中得到了3个突变体:C274A、R283G和H287A,并通过大肠杆菌E.coli表达。大部分精氨酸激酶都以包涵体的形式存在。经过纯化之后对3种突变体的催化活性和一些结构特征进行了分析。这3种突变体丧失了绝大部分催化活力,特别是突变体C274A,与野生型相比除了活性完全丧失之外,结构却几乎没有变化。这3个残基对海参精氨酸激酶结构或功能的保持有着重要作用,Cys274残基可能是海参精氨酸激酶的活性位点。     

p38α半胱氨酸点突变体真核表达载体的构建和表达

以pFLAG-CMV-5.1-p38α为模板,应用PCR定点突变技术将p38α的第39、119、162和211位半胱氨酸(Cys)点突变体定点突变为丙氨酸(Ala)(C39A、C119A、C162A、C211A),使用琼脂糖凝胶电泳及基因测序检测其结果;并采用脂质体转染法将p38α的野生型和突变体质粒分别转入HEK293细胞,免疫印迹鉴定野生型及其突变体p38蛋白表达。结果显示,构建的C39ApFLAG-CMV-5.1、C119ApFLAGCMV-5.1、C162ApFLAG-CMV-5.1和C211ApFLAG-CMV-5.1重组载体成功点突变,并在HEK293细胞中高效表达,为深入研究p38在缺血性脑损伤中的作用及机制打下基础。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

豆豉纤溶酶的定向进化

为提高豆豉纤溶酶的药用价值,通过易错PCR方法对来源于Bacillus subtilis DC-12的豆豉纤溶酶DFE基因进行突变并构建突变体文库,利用底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选.通过3轮易错PCR最终获得催化效率提高的突变酶mDFE3.序列分析表明突变酶mDFE3基因发生了6处碱基突变,其中4处突变发生氨基酸取代,2处为同义突变;通过swiss-model repository模拟突变酶mDFE3的结构,显示3个突变氨基酸位于回环结构上,1个位于α螺旋上;酶动力学测定结果表明突变酶mDFE3的Km值由0.58mmol/L降低至0.45mmol/L,突变酶mDFE3的催化效率(kcat)是野生型的2.57倍.     

地黄功能因子提取物体外抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

通过体外试验，探讨了DHTW抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶的抑制活性，为地黄降糖功能因子的开发利用提供理论依据.采用紫外分光光度法(UV)测定DHTW清除DPPH、ABTS等自由基的能力，利用酶标仪测定DHTW抑制α-葡萄糖苷酶的活性.结果表明：(1)DHTW均具有抗氧化活性，质量浓度在0～6 mg/mL内，随着浓度的增加，抗氧化活性也不断增加，当溶液达到一定浓度后，抗氧化性趋于稳定.(2)DHTW的DPPH自由基清除能力IC₅₀值分别为：醇洗脱物DHY(0.087 mg/mL)、粗提物DHC(2.987 mg/mL)、水洗脱物DHS(3.024 mg/mL)，故自由基清除能力表现为：DHY>DHC>DHS.(3)DHTW的ABTS自由基清除能力IC₅₀值分别为：DHY(0.137 mg/mL)、DHC(1.463 mg/mL)、DHS(2.168 mg/mL),ABTS自由基清除率表现为：DHY>DHC>DHS.(4)DHTW对α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，其中，DHY有较明显的抑制能力，α-葡萄糖苷酶抑制活性明显优...     

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

荔枝果肉多糖级分的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

为了探究不同荔枝果肉多糖级分的理化性质、抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异,采用DEAE-52离子交换树脂分离纯化得到2种荔枝果肉多糖级分LPI和LPII,比较两者的中性糖、糖醛酸和蛋白质含量,并采用氧自由基清除能力(ORAC)和细胞抗氧化(CAA)评价其抗氧化活性,采用对-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(PNPG)法探究其 α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果表明LPII含有较多的中性糖和蛋白质,较少的糖醛酸,表现出更强的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中LPI和LPII的 ORAC和CAA值分别是24.51,30.08μmol/g和5.36,8.72μmol/g,其抑制α-葡萄糖苷的IC₅₀值分别是0.33,0.26mg/mL。荔枝果肉多糖的生物活性与其中性糖和蛋白质含量密切相关。     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

秦岭中草药黄芩中黄酮类化合物的分离及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的分离鉴定秦岭中草药黄芩中的黄酮类物质并研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法植物原料用溶剂提取,常压硅胶柱色谱及制备液相色谱分离,高分辨质谱及核磁共振波谱分析确定化合物分子结构,PNPG法测定化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果分离鉴定了8种黄酮类化合物,分别是汉黄芩素(1)、黄芩素(2)、汉黄芩苷(3)、千层纸素A-7-O-葡萄糖酸苷(4)、白杨素-7-O-葡萄糖酸苷(5)、黄芩苷(6)、黄芩素-6-O-葡萄糖酸苷(7)和去甲汉黄芩素-8-O-葡萄糖酸苷(8),活性实验表明化合物1和7表现出较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性,其IC_(50)分别为0.13mmol/L和0.25mmol/L,稍强于阳性对照阿卡波糖(IC_(50):0.42mmol/L)。结论秦岭中草药黄芩中某些黄酮类物质能够有效抑制α-葡萄糖苷酶,具有与阿卡波糖相当的降糖作用。     

老鹰茶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

为探讨老鹰茶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,以老鹰茶为材料,经乙醇浸提得乙醇提取物,并通过高效液相色谱法对乙醇提取物主要成分进行分析,进而测定其对α-葡萄糖苷酶活性的影响.结果表明,老鹰茶乙醇提取物主要活性成分为黄酮类物质,该提取物对α-葡萄糖苷酶活性有较强的抑制作用,其半抑制质量浓度(IC50)为0.12mg/mL.进一步的酶动力学研究表明其抑制机理为可逆混合型抑制,对游离酶的抑制常数(KI)为0.058mg/mL,而对酶-底物络合物的抑制常数(KIS)为0.178mg/mL.由此可知,老鹰茶乙醇提取物能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性.该结果揭示老鹰茶有望成为抑制α-葡萄糖苷酶活性的保健或医疗产品原料,具有值得深入研究和开发应用的潜在价值.     

应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃.     

明胶酶解物抗凝血活性的检定及其机理的探讨

明胶经胰蛋白酶水解 ,其酶解产物具有抗凝血活性 .采用生物信息学方法 ,从胶原蛋白的氨基酸序列入手 ,运用序列比对软件 ,比对胶原蛋白与已知的抗凝血因子之间的一级结构和二级结构 ,为其相似的功能寻找序列和结构上的共同点 ,探讨明胶酶解物的抗凝血机理 .     

用荧光光谱与高效液相色谱法研究广西血竭的α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用冷浸法对广西血竭进行分离,测定各组分的α-葡萄糖苷酶的抑制活性.使用三维荧光指纹技术对其荧光指纹进行研究,发现抑制率与荧光指纹主峰强度的相关系数为0.9413.说明可用荧光指纹参数表征抑制剂的抑制活性.以三维荧光光谱信息为指导找出荧光强度最高处的激发发射波长对,作为高效液相色谱荧光检测器的检测波长,研究各组分色谱峰面积同其相应α-葡萄糖苷酶抑制率的相关关系,发现其中峰1、峰2、峰1 峰2与其抑制率的相关系数分别为0.9414、0.9678和0.9645.说明这两色谱峰所对应的抑制剂与α-葡萄糖苷酶的抑制活性直接相关,为血竭α-葡萄糖苷酶的抑制活性有效成分的筛选,找到了很好的指示方法和检测手段.     

罗汉果甜苷ⅡA的分离鉴定含量测定 及其降糖抗氧化活性研究

为了研究罗汉果中甜苷成分的生物活性及资源含量,为其进一步开发利用提供实验依据,本文通过柱色谱技术,从罗汉果中分离出罗汉果甜苷ⅡA(mogrosideⅡA);利用核磁波谱(NMR),对mogrosideⅡA进行波谱数据归属;通过α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测定,探讨罗汉果甜苷降血糖的可能机制;通过高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)法,分析不同产地罗汉果中mogrosideⅡA的含量。通过研究,本文为mogrosideⅡA提供了完整的尚未见报道的波谱数据;同时,研究结果表明,mogrosideⅡA具有较强α-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC_(50)为0.187±0.006 g/L,且呈现出剂量依赖的快速竞争性可逆抑制特点;另外,通过含量分析,发现产自永福县堡里镇的罗汉果中mogrosideⅡA的含量最高。     

鞭打绣球的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

利用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20等色谱法从鞭打绣球的95%乙醇提取物的乙酸乙酯部分中分离得到10个化合物.根据化合物的理化性质和~1H NMR、~(13)C NMR鉴定化合物为齐墩果酸(1),β-谷甾醇(2),紫丁香苷(3),苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(4),苄基β-D-吡喃葡萄糖苷(5),熊果苷(6),草夹竹桃苷(7),反式肉桂酸(8),顺式肉桂酸(9),丁香醛(10).其中化合物3～7和10为首次从该植物中获得.通过体外α-葡萄糖苷酶抑制模型对以上化合物进行活性筛选,结果显示化合物1和10对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用, IC_(50)值分别为(68.93±6.20)μmol/L、(71.77±6.46)μmol/L.     

8种傣药提取物体外抑制α-糖苷酶活性的研究

采用α-葡萄糖苷酶活性抑制酶学模型,以96微孔板法测定了8种具有降糖作用傣药的石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、水提取物体外对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,筛选具有葡萄糖苷酶抑制作用的有效部位.结果表明:8种傣药的提取物均有α-葡萄糖苷酶抑制活性,抑制作用强度与其浓度呈正相关.其中,黑皮跌打藤茎,其正丁醇提取物活性最高,IC50=17.74μg/mL,显著优于对照药物阿卡波糖.     

地骨皮水提取物的化学成分

目的:研究中药材地骨皮Lycii Cortex(root bark of L.chinense or L.barbarum)水提取物的化学成分及单体化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性.方法:利用多种柱色谱技术进行化学成分分离,通过化合物的理化性质及波谱数据鉴定其结构,采用α-葡萄糖苷酶活性测定方法对所分单体化合物做体外α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选.结果:从中药材地骨皮的水提取物中分离得到10个化合物,分别鉴定为:打碗花精生物碱B1(1)、打碗花精生物碱B2(2)、打碗花精生物碱B3(3)、打碗花精生物碱C1(4)、L-苯丙氨酸(5)、鸟苷(6)、grateloupinamide(7)、尿囊素(8)、(+)-南烛木树脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖(9)、(-)-南烛木树脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖(10).结论:化合物5~8及10均是首次从中药材地骨皮中分离得到;化合物1~4具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性.