碱性蛋白酶交联聚集体的制备及其催化性能研究

碱性蛋白酶在食品、医药、酿造、丝绸、皮革等行业中发挥着重要作用。制备了碱性蛋白酶交联体,并对其催化性能进行研究。在最佳制备条件下(90%叔丁醇作为沉淀剂,沉淀时间为15min,交联剂浓度为33mmol/L,交联时间为6h),交联酶的酶活回收率为22.6%。与游离酶相比,交联酶的最适pH值向碱性方向变化,由7.5变为8.0,最适温度由60℃变成65℃。酶动力学研究表明,交联酶对酪蛋白的催化水解能力(4.3min-1)比游离酶(3.7min-1)更高。尽管交联酶最大反应速度V_max(9.8mg/(mL·min))低于游离酶(13.3mg/(mL·min)),但交联酶对底物的亲和力K_m(2.3mg/mL)比游离酶(3.6mg/mL)有所增加,而且其热稳定性和酸碱稳定性都得到一定程度的提高。另外,在磷酸盐缓冲液中重复使用5和8批次后,交联酶还能保持82.5%和56.5%的酶活性。     

乳化法制备交联海藻糖合酶聚集体的研究

交联酶聚集体(CLEAs)是一种高活性的无载体固定化酶,常用的基于溶液法(Sheldon CLEAs呈无定形的集簇体,影响其连续使用效率.以海藻糖合酶为模型酶,首次在油包水乳化体系CLEAs,利用扫描电镜和光学显微镜分析了所得CLEA的微观结构,考察了CLEAs的活性和重复使果表明,乳化法制备的CLEAs外观呈较规则的微球形,粒径约20~60μm,其活性和重复使用性能均Sheldon法制备的CLEAs.     

里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

里氏木霉制备木聚糖酶的产酶历程

以玉米芯木聚糖为原料,里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０为菌种,采用改进的Ｍａｎｄｅｌｓ配方制备木聚糖酶,产酶历程与制备纤维素酶时有较大差异。具体表现在产酶周期短,ｐＨ值基本无下降的趋势,酶液中可溶性蛋白质浓度较低。底物浓度为７ｇ／Ｌ时,木聚糖酶活力达１２５６ＩＵ／ｍＬ,比活力、酶得率及酶产率分别为８１９０ＩＵ／ｍｇ蛋白质、１７９４３ＩＵ／ｇ木聚糖和４１８６．７ＩＵ／Ｌ·ｄ。产酶最终ｐＨ应控制在６～７较为适宜,酶活力最高。ｐＨ超过７．０,酶可能失活。酶解结果表明,木聚糖酶对木聚糖干粉具有很高的降解效率,当每克底物的酶用量为０．１克木聚糖干粉产的酶液量时,酶解得率一般可达９０％左右。     

磁性交联核酸酶P1聚集体的制备及性质研究

采用磁性纳米颗粒与酶蛋白共沉淀后经戊二醛交联的方法,制备了磁性交联核酸酶P1聚集体,并且对比分析了游离酶和固定化酶的部分酶学性质.优化的最佳制备条件为:硫酸铵质量浓度为0.8 g/mL,沉淀时间为0.5 h,戊二醛体积分数为0.6%,交联时间为2 h,所制得的固定化酶活性回收率为32.4%.酶学性质研究表明,固定化酶的Km值(30.7 mmol/L)明显高于游离酶的(7.27 mmol/L),二者最适反应温度分别为90℃和75℃,最适pH值均为5.2,固定化核酸酶P1对热和酸碱的耐受性明显增强,连续反应6次后酶活力仍保留70%,良好的操作稳定性和磁响应性有利于核酸酶P1的工业化应用.     

添加纳米粒子对脂肪酶交联酶聚集体活性及结构的影响

将纳米TiO2、纳米MgO和纳米Cu分别引入假丝酵母脂肪酶（Candida sp. 1619）的交联酶聚集体（CLEAs）制备过程，获得相应的纳米粒子-CLEAs，采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分析仪(SLP)等分析了纳米粒子对CLEAs活性和结构的影响。结果表明与未加纳米粒子的CLEAs相比，适量纳米TiO2的加入可提高CLEAs的酶活，最大增加15.2%；而不管添加浓度大小，纳米MgO、纳米Cu对CLEAs酶活均有抑制作用，酶活下降63.7%~97.9%。SEM、SLP分析结果表明，与未添加纳米粒子时相比，加入纳米TiO2的CLEAs粒径变小，粒度较均匀，孔道增加；而纳米MgO-CLEAs和纳米Cu-CLEAs则出现粒度不均匀性增加、粒径范围扩大、孔道减少的现象。FTIR分析结果表明，加入3种纳米粒子后CLEAs二级结构中有序结构（α-螺旋、β-折叠）/无序结构（β-转角、无规则卷曲）值显著提高，顺序为纳米TiO2-CLEAs（0.55）>纳米MgO-CLEAs（0.43）>纳米Cu-CLEAs（0.35）>CLEAs（0.28），这与纳米粒子-CLEAs酶活顺序不一致，表明纳米粒子可能还存在其他影响CLEAs酶活的途径。     

酸性木聚糖酶产生菌XYW5的筛选及酶学性质

【目的】选育优良的产酸性木聚糖酶的微生物,考察酸性木聚糖酶的酶学性质(尤其是pH值为4.0),为实现纤维素乙醇低成本清洁生产打下基础。【方法】从广西大学农场采集土壤,富集后经产酸性木聚糖酶的培养,比较酸性木聚糖酶酶活力,选育酸性木聚糖酶高产菌株,鉴定菌种,分析酶学性质。【结果】筛选出产酸性木聚糖酶酶活力较高的菌株XYW5。扩增菌株XYW5的ITS rDNA序列,经测序分析比对,将其初步鉴定为日本曲霉Aspergillus japonicus XYW5。菌株XYW5产酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(26. 26±0. 97)U/mL和(0.63±0.02) U/mL,比活力分别为(85.50±0.63) U/mg和(1.80±0.01) U/mg;其酸性木聚糖酶最适温度和最适pH值分别为65℃和6.5,酸性木糖苷酶最适温度和最适pH值分别为70℃和4.5;酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,达到8.54 U/mL。【结论】菌株XYW5所产的酸性木聚糖酶具有开发成为优良工业酸性木聚糖酶的潜力。     

苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体的制备及部分催化性能研究

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酶法生产L-苯丙氨酸的关键酶,目前主要利用红酵母PAL进行转化,但红酵母PAL稳定性较差,妨碍了其工业化的应用。该研究将交联酶聚体和印迹酶的制备方法相结合,制备出新型固定化酶-苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体,筛选出最优的底物印迹分子,并考察了该固定化酶的部分特性。结果表明,反式肉桂酸是制备印迹PAL交联酶聚体的最适底物,所制备印迹交联酶聚体的最适催化温度和pH值分别是50℃和10.5,并表现出较好的重复使用性,连续催化9个批次后,仍保持了32%的酶活保留率。     

高产芽孢杆菌MS12木聚糖酶发酵条件优化及酶学性质研究

从昆明某磷矿土壤中筛选出一株产木聚糖酶能力较强的菌株——MS12,通过单因素试验初步优化了该菌株的产酶条件.试验结果显示,该菌株最佳产酶培养基为玉米芯粉50 g/L、麸皮40 g/L、NH_4Cl 10 g/L、CaCl_2 5 g/L、NaHPO_42 g/L,pH自然;最佳产酶发酵条件为30℃,180 r/min,装样量30 mL/250 mL三角瓶,震荡培养96 h.经测定,菌株MS12所产木聚糖酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.0,具有较好的pH稳定性. 1 mmol/L Na~+、Ba~(2+)和10 mmol/L Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Ag~+对酶活有明显的抑制作用.     

壳聚糖作载体制备固定化酶的方法

综述了以壳聚糖为载体制备固定化酶的几种主要方法及其特点。     

蜂房芽孢杆菌木聚糖酶的活性

实验研究了温度、pH值和Al^3 、Zn^2 、K^ 、Ca^2 、Mg^2 、Mn^2 、Fe^3 及Cu^2 等几种常见金属离子对蜂房芽孢杆菌木聚糖酶活性的影响，结果表明该酶最适温度为40℃，最适pH为6．0，在低温及pH7．0—9．0条件下，该酶活性稳定；Ca^2 、Mg^2 、Mn^2 对木聚糖酶有激活作用，Cu^2 、Al^3 、Zn^2 和Fe^3 对木聚糖酶有抑制作用，Cu^2 的抑制作用最强。     

以粗孔微球硅胶为核芯的交联酶聚体的制备

采用苯丙氨酸解氨酶(PAL)为模型酶,制备了以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(NH-PAL-CLEAs),优化了制备条件。并研究了NH-PAL-CLEAs的部分催化性能。研究结果表明,当硅胶量为117.75mg,酶液添加量为1mL(2U),戊二醛浓度为0.2%(体积分数)时,所制备的NH-PAL-CLEAs的最大酶活回收率是25%。与传统的PAL-CLEAs相比,NHPAL-CLEAS无需离心或过滤,只用短时间静置就能被回收重复利用。同时,NH-PAL-CLEAs也表现出较好的操作稳定性。这种制备方法不仅克服传统制备交联酶聚体(CLEAs)颗粒小、难回收,离心或过滤回收易结块的问题,而且缩短了生产周期,减少了能源消耗,提高了固定化酶的利用率,是一种非常具有工业应用前景的固定化酶方法。     

青霉菌m8产胞外木聚糖酶的培养条件及其性质研究

适合青霉菌m8产胞外木聚糖酶的培养基含4．00％麦草粉,0．45％（NH4）2SO4,0．10％KH2PO4,0．05％MgSO4·7H2O,0．03％NaCl,0．30％Tween80,0．10％CaCO3在上述培养基中,28℃恒温振荡（120r／min）培养4～5d,木聚糖酶活力可达90u／mL左右．该酶的最适pH值为4．6,最适反应温度为55．5℃;该酶的耐热性比较强,可被K＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活,而被Ag＋、Fe3＋、Cu2＋离子抑制;青霉菌ms的Km为5．0×10－2g／L．     

低聚木糖生产用木聚糖酶的制备和测定

采用沉淀剂G处理黑曲霉1—13菌株的粗酶液获得木聚糖酶制剂。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳酶谱分析测定该酶制剂为单-木聚糖酶组分。经一系列研究结果表明,该酶制剂无β-木糖苷酶活力和羧甲基纤维素酶活力,水解玉米芯木聚糖的产物主要为木二糖和少量木糖。由此可见,此木聚糖酶制剂的底物专一性较强,可直接以玉米芯为底物,选择性水解玉米芯中的木聚糖,生产低聚木糖。     

壳聚糖固定化风味蛋白酶的制备及其酶学特性

研究了球形交联壳聚糖固定化风味蛋白酶的制备工艺及其酶学特性.以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂,采用共价交联法制备固定化风味蛋白酶的较适条件为ω(壳聚糖)=2.5％、ω(NaOH) =3％、ω(戊二醛)=0.5％,交联时间6h,载体中∞(酶)=40 mg/g,于35℃、pH值5.5条件下固定化反应10h.固定化后,风味蛋白酶较适反应温度从50℃提高至70℃,较适pH值从7.0提高至8.0,且可在更宽温度与pH值范围内保持较高的酶活力.固定化风味蛋白酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性,可反复多次使用,适宜于在工业生产中推广应用.     

交联型单分散改性聚苯乙烯微球的制备与表征

以苯乙烯（St）为单体,对苯乙烯磺酸钠（NaSS）为共聚单体,二乙烯基苯（DVB）为交联剂,制备了单分散交联聚苯乙烯（PS）功能微球,用场发射扫描电子显微镜(FESEM)、动态光散射（DLS）、Zeta(ζ)电势分析仪、核磁共振交联密度仪、同步热分析仪等对其进行了表征。研究了交联剂、共聚单体的用量对微球粒径及表面电荷的影响。结果表明：所制得的微球粒径在100~400nm 之间,表面带负电荷,呈单分散性;共聚单体用量增加,微球粒径减小,表面ζ电势增强;微球表面电荷基本不随放置时间变化而改变,稳定性好。     

康氏木霉木聚糖酶的分离纯化及特性

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐和Sephadex G-100凝胶色谱等分离纯化技术，从康氏木霉（Trichoderma Koningii）发酵液中分离出木聚糖酶，纯化后的木聚糖酶经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳鉴定为单一组分，其相对分子质量为55208．所得的木聚糖酶的最适反应温度为65℃，pH值为6．0．该酶稳定性较好，在30—60℃下放置2h能保持83％以上的酶活；在3．0-10．0的pH值范围内能保持85％以上的酶活．研究表明：金属离子Ba^2＋，Pb^2＋，Fe^2＋，Fe^2＋，Al^3＋和高浓度（12mmol/L）的Cu^2＋对木聚糖酶的活性有抑制作用，而Ca^2＋，Zn^2＋和4mmol／L的Cu^2＋对该酶反应有促进作用．该木聚糖酶作用于Birchwood木聚糖的米氏常数为5．37g/L，最大反应速率为0．94μmol／min．     

以响应面法优化短小芽孢杆菌木聚糖酶产酶条件

应用响应面分析对短小芽孢杆菌木聚糖酶的产酶条件进行优化,得到碳源、氮源及培养时间3种因素交互影响的回归方程.从该方程得到理论最佳产酶条件:培养时间为24h,麸皮、玉米粉、蛋白胨和NH4Cl的质量浓度分别为10,5,5,10g.L-1.在优化条件下,实际最高产酶量为12.1mkat.L-1,与理论最高产酶量12.0mkat.L-1接近,比初始酶活提高12.2倍.