奶牛胎儿细胞多位点基因打靶的研究

利用奶牛rDNA基因间的ITS重复序列作为靶位点,对奶牛胎儿成纤维细胞进行多位点基因打靶,建立以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,并为克隆定点转基因奶牛提供核供体。首先分离培养出奶牛胎儿成纤维细胞,并进行性别鉴定和核型分析。采用MTT比色法确定了G418和GCV正负筛选的最低有效浓度。然后通过多位点基因打靶载体转染、正负筛选获得7个表达绿色荧光的克隆细胞系,经PCR,RT-PCR和测序证实其中1个细胞系为定点整合的克隆细胞系,且GFP基因表达。     

宿主细胞DNA损伤反应与重组腺相关病毒载体基因表达

文中主要讨论细胞DNA修复机制与重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体的相互关系,探讨通过调节宿主细胞DNA修复机制,提高rAAV载体表达及基因打靶效率的方法,进而提高rAAV载体基因表达的可能性.     

高效率基因打靶载体的构建及受体成肌细胞的制备

通过建立高效率“双无”（无启动子、 无polyA）打靶载体MSTN-GFP和MSTN neo及新生绵羊和胎儿成肌细胞的培养和鉴定, 优化了培养条件, 改善了细胞状态, 为提高打靶效率及体细胞克隆提供了稳定的核移植供体； 同时无启动子打靶载体的构建也有利于打靶后阳性细胞克隆的分子鉴定.     

小鼠基因敲除的研究进展

随着人类基因组计划(HGP)的顺利完成,后基因时代的生物学研究迫切需要一种有效的基因功能分析方法。基因敲除小鼠模型的应用,为研究基因的功能和寻找新的治疗人类疾病的干预措施提供了有力支持。基因打靶和基因捕获是两种不同的通过胚胎干细胞(ES细胞)制作基因敲除小鼠的技术。基因捕获具有高通量、随机性、序列标记等特点,而基因打靶则是针对特定基因的敲除。自基因打靶和基因捕获小鼠首次亮相距今已有近20年的时间。近年来,针对基因打靶和基因捕获的新工具不断涌现,并且相应的组织也已经成立。这些组织能够利用这两种方法敲除小鼠基因组中的基因。国际基因捕获协会(The International Gene Trap Consortium,IGTC)和基因敲除小鼠计划(The Knockout Mouse Project,KOMP)已着手创建世界范围内用于科研的便利资源,并且计划敲除所有小鼠的基因。KOMP的组织者认为这与HGP一样具有重要意义。从传统的基因打靶到现在的高通量的条件基因打靶,基因打靶的方法已经发生了很大的变化。捕获和打靶两者的组合优势大大提升了基因捕获的范围和基因打靶的效率。作为一种新开发的插入式突变系统,转座子在捕获基因方面比逆转录病毒更具有优势。国际基因敲除小鼠协会(The International Knockout Mouse Consortium,IKMC)的出现标志着全球性合作的开始。该组织致力于系统地敲除小鼠基因组中所有基因,进而开展功能基因组的研究。     

通用型奶牛多位点基因打靶载体系统的构建

以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶I-SceI切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,将部分解决目前存在的打靶效率低、安全性差等问题.     

基因表达系列分析在肿瘤研究中的应用

基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)是一种快速分析基因表达信息的技术.它不但能快速、详细地分析成千上万个基因,还能发现新基因,因此是基因表达定性和定量研究的一种新的有效手段.近年来此技术广泛应用于肿瘤的研究,了解肿瘤发病机制,识别诊断和治疗肿瘤的新基因.可以预测SAGE在肿瘤研究和诊断过程中的应用将会对肿瘤的认识和治疗产生深远的影响.     

靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA的构建与鉴定

mdr 1基因及其表达产物P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药(MDR)的主要原因,抑制mdr 1基因的表达可用于逆转MDR.RNAi可用于特异抑制靶基因的表达,本研究的目的是构建获得可特异有效靶向mdr 1基因的siRNA元件.应用siRNA设计软件与mRNA结构分析软件设计构建了3个分别靶向mdr 1基因mRNA环结构和茎结构的siRNA元件,同时构建了携带mdr1基因序列的luc报告质粒,通过siRNA表达质粒与携带靶序列的报告质粒的共转染抑制实验检测不同siRNA的抑制效率,结果显示靶向环结构siMDR1B具有较好的抑制效率和特异性.进一步将siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染细胞,应用免疫流式细胞术检测显示,相比对照细胞,siMDR1B可显著抑制其转染后mdr1基因产物P-gp蛋白的表达活性.同时采用CCK-8细胞活性检测试剂评价了siMDR1B对细胞活性的影响,结果显示siMDR1B不会影响细胞活性,具有良好的特异性.本研究获得的可有效靶向mdr 1基因的siRNA元件可为进一步开展逆转MDR研究提供重要基础.     

沉默SEMA3A基因对胶质瘤细胞U251增殖和转移的影响

探讨了SEMA3A基因在恶性胶质瘤细胞U251迁移和侵袭能力中的作用, 及其用于胶质瘤临床治疗的可行性. 用特异识别SEMA3A基因的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)片段与真核表达载体pFH-GFP-L连接, 再与辅助质粒联用来包装慢病毒. 通过荧光显微镜观察感染胶质瘤细胞U251的感染效率. 通过实时定量PCR技术和Western-blot技术验证了U251细胞中SEMA3A基因的沉默效果. 通过MTT法、PI染色法和Transwell小室分别检测了U251细胞增殖、细胞周期和运动能力的变化. 结果表明, SEMA3A-shRNA慢病毒感染U251能有效下调SEMA3A基因的表达水平(P <0.01), 使U251细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力明显降低(P <0.05), 细胞大量阻滞在G2/M期, 并促进了细胞凋亡(P <0.05).     

HSVTK gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells

The long-term success of gene therapy for cancer relies heavily on the development of effective targeting systems. We investigate the possibility of targeted gene therapy using promoter of carcinoembryonic antigen (CEA) gene. By using luciferase reporter gene, we found that CEA promoter exhibit 16 times high activity in CEA-producing lung cancer cells, A549 than in nonproducing cells, Hela. We also constructed a recombinant expression plasmid pCEATK, in which CEA promoter drives the effector gene, thymidine kinase gene of Herpes Simplex Virus (HSVTK). A549 cells transfected with pCEATK became 865 times more sensitive to ganciclovir (GCV) than the control cells. However, Hela cells transfected with this plasmid remained resistant to GCV. These data indicate the potential for targeted gene therapy using the CEA promoter against CEA-producing tumor cells, such as lung cancer cells. Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China Natural Science Foundation of Hubei Province Biography: XIAO Geng-fu(1966-), male, phD graduate candidate, Lecturer.     

心血管疾病的基因治疗

基因治疗在先天遗传性以及后天获得性心血管疾病治疗中均具有广阔的发展前景. 对心血管疾病致病机理的深入认识和疾病基因组学研究的发展, 进一步促进了临床前基因治疗的研究进展. 但基因治疗过程中存在的机体细胞免疫反应、外源基因表达水平不足、在体基因转导效率低下等因素都成为基因治疗临床应用转化的瓶颈. 近年来, 基因导入载体和基因组编辑技术的发展为上述问题的改善和解决提供了新的思路. 目前成族规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas9 基因组编辑技术已经成功应用于动物模型的在体基因编辑, 达到了显著改善血脂指标的疗效. 进一步研究体内组织特异和高效的基因导入方式, 提高基因编辑的靶向效率和特异性, 并建立全面有效的安全评估实验体系, 将推动基因治疗向临床应用的转化. 针对心血管疾病基因治疗中基因导入载体的研究以及CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用展开讨论.     

壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究

设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz),以壳寡糖(COS)为材料,建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系,并研究其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COS-EGFR DRz复合体转染效率为88.7%,与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RT-PCR结果显示,经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA,使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0～G1期,并且出现凋亡现象,其中COS组的凋亡率为19.3%,大于对照组脂质体的凋亡率13.0%.研究表明,COS较脂质体有相似的转染效率和更低的毒性,是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体.     

2016年生命科学热点回眸

 生命的鲜活特点及其活动规律的复杂性,使得其研究中任一新发现都备受世人关注。2016年,生命科学领域的研究进展振奋人心。本文从不胜枚举的研究成果中选择了几例,介绍和评述了2016年在癌细胞诱导的内皮细胞死亡、耐药性基因突变的新型肺癌异位抑制剂、极大程度减少脱靶现象的基因靶向方案、利用双重受体改造型T细胞的精确肿瘤杀伤疗法、肿瘤高效免疫疗法、利用HIV病毒普效性抗体的艾滋病高效免疫疗法、可特异清除攻击病人自身组织淋巴细胞的自身免疫病疗法,以及晶体再生手术的革新、神经突触剪切机理的解析等方面的研究进展。特别是肿瘤治疗问题、基因编辑问题等,几乎一直保持着持续的热度,而在2016年又取得卓著成果。     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

基因打靶技术在实验动物中的研究进展

简要阐述了基因打靶的概念和基本环节 ,系统介绍了筛选方法和基因打靶的策略。基因打靶在基因功能研究、人类疾病动物模型的建立和基因治疗等方面有着广阔的应用前景     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

以bcl-2为靶标siRNA-2提高HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性

目的:研究以bc l-2基因为靶标有效siRNA-2(sm all interference RNA)能否提高HL-60细胞对阿糖胞苷(Ara-C)的敏感性。方法:将siRNA-2转入HL-60细胞株并与Ara-C联合培养,于24、48、72 h,用MTT法检测细胞增殖生长,用流式细胞仪检测HL-60细胞bc l-2蛋白的表达率、细胞内活性氧(ROS)水平变化及细胞线粒体膜电位的变化。结果:siRNA-2明显提高HL-60细胞对Ara-C敏感性;抑制细胞bc l-2蛋白的表达,提高细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位(P<0.05)。结论:siRNA-2能提高白血病细胞HL-60对Ara-C敏感性。     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

利用RNAi技术鉴定哈茨木霉聚酮合酶基因pkst-1的功能

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是优良的生物防治真菌,能产生抗生性聚酮化合物(polyketides).目前没有关于催化木霉聚酮化合物合成的聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)的相关编码基因的报道,这限制了对聚酮化合物代谢合成途径的研究.该研究通过融合PCR技术获得哈茨木霉的聚酮合成酶pkst-1基因的编码区序列,成功构建了RNAi介导的pkst-1基因沉默表达载体,使pkst-1基因的表达量在mRNA水平上显著降低.pkst-1基因失活使转化子发酵液产生了类似基因敲除的抑菌效果,降低了哈茨木霉抑菌能力,研究表明pkst-1基因编码催化抗生性聚酮化合物合成的关键酶.此外,RNA干扰技术在研究中的成功应用为哈茨木霉或其它丝状真菌的次级代谢合成途径相关基因的功能鉴定提供新的研究思路.