拟南芥突变体与基因功能研究

当前,突变体已成为功能生物学研究的重要工具.文章综述了模式植物拟南芥在群体遗传变异、自发突变体表型、人工突变体库构建、突变体基因功能分析等方面取得的进展.拟南芥突变体的研究能促进其在功能、进化上的了解,更有助于其他高等植物的基因功能分析。     

拟南芥花粉表面蛋白基因T-DNA插入突变体的鉴定

花粉表面蛋白质（Pollen coat proteins,PCPs）是一类在被子植物进行繁殖生长过程中起着重要作用的蛋白质．它们参与了花粉与柱头的识别、黏附、水合等过程,直接影响花粉的萌发能力．根据已经建立的拟南芥花粉表面蛋白数据库中的信息,从关国拟南芥生物资源中心购买了有T—DNA插入的SALK株系种子,并对这些株系进行了T—DNA插入位点的鉴定,实验结果为进一步研究花粉表面蛋白质奠定了基础．     

拟南芥热敏感突变体的研究进展

在自然界中,植物经常会遭受多种恶劣环境的胁迫,高温胁迫就是其中之一.由于温室效应导致全球气温不断升高,高温胁迫频发且强度也愈来愈大,因此,有关植物耐热分子机理和耐热相关基因研究的重要性也更加凸显.本文作者综合介绍了多种拟南芥热敏感突变体的最新研究成果,及其耐热相关基因的生物学功能,以期为今后研究植物耐热提供借鉴.     

拟南芥耐硒突变体的筛选和鉴定

文章采用不同质量浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)对拟南芥突变体库中的2121株拟南芥进行筛选,筛选出29株候选突变体,最终得到2株稳定突变体vsel1和vse2,通过表型鉴定和生理生化鉴定确定是突变体.该研究为耐硒基因克隆及功能分析奠定了基础,对于揭示植物耐硒的分子机理具有重要的理论意义.     

白光下拟南芥隐花素双突变体及其野生型的蛋白质组学比较分析

隐花素是植物的蓝光受体,在植物中调节多种光形态建成,包括抑制下胚轴的伸长、子叶的伸展和调节植物的开花时间等,但隐花素依赖蓝光调节光形态建成的分子机制仍然不清楚．采用双向凝胶电泳对生长在白光下的拟南芥隐花素双突变体及野生型的幼苗全蛋白进行分离,通过考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱．选取了55个差异蛋白质点采用MALDI—TOF—TOF—MS进行肽质谱指纹图分析,最终有33个蛋白质点得到了可靠鉴定．其中在crylcry2中相对于野生型下调的有9个蛋白,其他蛋白均表现为上调．这些在白光处理下差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢、细胞组织结构、抵抗压力和解毒、蛋白质的折叠和细胞壁的形成等功能,而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体．对其中5个蛋白质点的基因进行了半定量RT—PCR分析,发现这几个蛋白质点的表达与基因的表达基本一致．这些分析结果表明光控制拟南芥的发育是通过共调节许多相关基因的表达而实现的．     

白光下拟南芥隐花素双突变体及其野生型的蛋白质组学比较分析

隐花素是植物的蓝光受体,在植物中调节多种光形态建成,包括抑制下胚轴的伸长、子叶的伸展和调节植物的开花时间等,但隐花素依赖蓝光调节光形态建成的分子机制仍然不清楚.采用双向凝胶电泳对生长在白光下的拟南芥隐花素双突变体及野生型的幼苗全蛋白进行分离,通过考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了55个差异蛋白质点采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有33个蛋白质点得到了可靠鉴定.其中在crylcry2中相对于野生型下调的有9个蛋白,其他蛋白均表现为上调.这些在白光处理下差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢、细胞组织结构、抵抗压力和解毒、蛋白质的折叠和细胞壁的形成等功能,而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体.对其中5个蛋白质点的基因进行了半定量RT-PCR分析,发现这几个蛋白质点的表达与基因的表达基本一致.这些分析结果表明光控制拟南芥的发育是通过共调节许多相关基因的表达而实现的.     

拟南芥抗旱突变体的筛选和鉴定

文章采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫,以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体,筛选出2株候选突变体,最终得到1株稳定突变体vem1,通过表型和生理生化鉴定,确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础,对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。     

拟南芥网格蛋白重链突变体的遗传分析

利用PCR方法分离筛选了拟南芥网格蛋白重链T-DNA插入突变体chc1和chc2,并观察了CHC功能缺失后对植株发育的影响.结果表明：拟南芥网格蛋白重链CHC1或CHC2功能缺失引起部分植株发育异常,表现出生长素相关的发育表型,如幼苗子叶出现棒状、喇叭状和扇形等各种异常表型;通过人工杂交未能获得chc1chc2纯合双突变体,表明CHC1和CHC2功能同时缺失可能引起花粉致死或胚胎致死.这些遗传分析结果表明CHC在植物发育过程中具有重要的生物学功能.     

拟南芥抗盐突变体的筛选

盐胁迫是影响植物生长发育的非生物胁迫因素之一,目前发现的盐胁迫信号途径的基因还非常有限.发掘新的耐盐相关基因对于了解植物的盐胁迫响应机制和改善作物的耐盐性具有非常重要的意义.从EMS突变体库中筛选突变体是一种经典的正向遗传学方法,有可能筛选到从T-DNA插入突变体库中无法发现的新基因.本实验用160mmol/L NaCl作为盐胁迫的筛选条件,以在含盐平板上长出绿色子叶作为筛选指标筛选抗盐(Salt Resistant,ST)的EMS突变体,初步筛选到了140株ST突变体,其中84株收到了种子,第二代进行抗盐表型确定后,得到了15株表型稳定的ST突变体,均表现出明显的抗盐表型,并对其中的一些突变体做了初步的表型及基因定位分析.     

大豆滞绿突变体的T-DNA插入位点分析

通过农杆菌介导的子叶节转化法获得的大豆T-DNA插入突变体ls-1是一个滞绿突变体,该突变体同时表现出花器官异常和种子败育的表型.通过染色体步移的方法分析发现T-DNA插到大豆基因组的7号染色体上,对测序获得的插入位点序列进行了PCR验证.进一步通过半定量RT-PCR和生物信息学分析,推测突变体表型的产生可能由于T-DNA插入编码S1型核酸内切酶的基因Glyma.07G191100和编码线粒体中交替型NAD(P)H脱氢酶的基因Glyma.07G191200之间,使二者表达受到影响造成的.该研究为后续的基因功能研究奠定了基础.     

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理,确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90μmol/L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标,对拟南芥化学诱导激活标签(XVE)T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1/2MS培养基进行大规模筛选,挑选根长抑制明显的植株,单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol/L CdCl2的1/2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130,并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.     

T-DNA标签在植物基因组中的应用

随着大量被转化植物群体的获得，以及基因组测序技术的发展，T-DNA标签逐渐被用于基因功能的确定。本文重点介绍如何用T-DNA标签来研究基因功能。     

黄瓜芽黄突变体叶片的蛋白组学研究

为筛选影响芽黄现象的差异表达蛋白,采用双向电泳-质谱技术研究黄瓜芽黄突变体与正常黄瓜的蛋白表达差异。提取相同生长时期的芽黄突变体黄瓜yh与正常黄瓜的叶片组织的总蛋白,进行双向凝胶电泳,其结果应用PDQuest软件分析。共选取22个蛋白进行MALDI-TOF质谱分析,结果表明,22个蛋白中芽黄突变体中上调表达的有7个,正常黄瓜中上调表达的有6个,无明显差异的蛋白9个。本实验成功建立了黄瓜芽黄突变体双向电泳分析体系,并筛选出差异蛋白,为黄化突变体分子机制研究奠定了一定基础。     

Isolation and characterization of rice lesion mimic mutants from a T-DNA tagged population

A rice ( Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) T-DNA tagged population consisting of about 7000 individual lines was generated and screened for rice lesion mimic mutants in the T1 generation. Ten lines were found to develop spontaneous lesions in the absence of pathogen infection and displayed distinct lesion phenotypes. These mutants were tentatively designated as lm1 -lm10 (for lesion mimic), respectively. Lesion formation of lm mutants was developmentally regulated, and all the mutants showed stunted growth and reduced fertility. Genetic analysis demonstrated that all the mutations were recessive, and five partially fertile mutants (lm4-lm8) were derived from different loci. Mimic lesions occurring on the leaves of lm mutants resulted from cell death as revealed by trypan blue staining. Six of them ( lm3 -lm8 ) exhibited enhanced resistance to five bacterial blight isolates, indicating their wide-spectrum resistance to this pathogen. These results imply that some lesion mimic mutations of rice might be involved in disease resistance signaling pathways,and that isolation of these mutated genes may be useful for elucidating molecular mechanisms of plant disease resistance. Among the mutants, only one mutant, lm6, was preliminarily shown to cosegregate with the inserted T-DNA in its T1 generation, making it feasible to isolate the gene responsible for the phenotype of this mutant.     

拟南芥温敏雄性不育突变体atms1的获得及表型分析

从甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate,EMS）化学诱变建立的野生型拟南芥（Col-0）突变体文库中筛选到1株突变体.在低温16 ℃时,该突变体的雄性育性与野生型没有显著差异,花粉染色呈现100%可育.随着培养环境温度的升高,突变体花粉育性逐渐下降,因此,该突变体为一温敏雄性不育突变体,并被命名为atms1（ambient temperature-sensory male sterility 1,即环境温度敏感雄性不育1）.花药切片结果显示,在23 ℃以下,该突变体花药各个发育时期的形态与野生型花药没有显著的差异;而27 ℃处理1周后的突变体花药呈现多种表型：同一朵花中各个花药的发育时期出现显著分化,花粉母细胞胼胝体单薄,绒毡层发育滞后于同时期的野生型花药.遗传分析确定,atms1的不育表型是由单个隐性核基因控制的.     

拟南芥低光效突变体lpe1的筛选和特性分析

利用叶绿素荧光仪对化学诱变剂乙酰甲基磺酸(EMS)诱变的野生型拟南芥(Col-0生态型)F2代幼苗进行叶绿素荧光突变体筛选,获得了一株低光合效率突变体lpe1(low photosynthetic efficiency 1).遗传分析结果表明,lpe1是一个单基因隐性突变体.在生长发育的各个时期,lpe1叶片的叶绿素荧光值、叶绿素含量、淀粉含量和总蛋白含量明显低于野生型.     

一个新的拟南芥雄性不育突变体的鉴定

前期研究表明,高度不育的infer1含有arf8-1和fer1-1.利用TAIL-PCR,研究组已经证实fer1-1为一个T-DNA插在At4g33050基因(鳊码Fer1蛋白)的突变体.于是,研究组从ABRC(the Ambidopsis Biological Re-souce Center)购买了At4g33050的另一个T-DNA插入突变体fer1-2.在fer1-2与arf8-1的杂交后代F2中,得到了一个与infer1明显不同的部分雄性不育突变体,命名为infer2,该不育株的所有后代均为部分不育.表型鉴定表明infer2在花发育、花的形态结构、角果的形态结构、植株的营养生长和植株的育性等方面与infer1比较存在明显差异.分子标记分析表明infer2仅含有arf8-1的分子标记而不含有fer1-2的分子标记.因此,可以确定infer2是一个不同于infer1的新的拟南芥雄性不育突变体.infer1和infer2均可作为植物雄性不育分子机制研究的良好材料.     

拟南芥花粉发育相关突变体gpl1的表型分析及遗传定位

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col生态型种子为材料,经EMS诱变获得一株后代表型分离比异常的突变体gpl1(group less 1,gpl1),进一步观察发现,其果荚短小萎缩,不能产生种子,花粉败育,成熟花粉粒无细胞核.另外,F1代的表型分析显示gpl1突变体的性状是受隐性基因控制,而F2代的遗传分离比分析显示gpl1突变体不遵循经典的遗传分离比定律.对gpl1基因进行图位克隆,并将其定位于2号染色体上T9J22与F12C20两个分子标记之间202kb的区段内.     

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略. 双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式. 为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中含有一个抗除草剂基因bar, 3个抗逆相关基因(DREB1A, Na+依赖性Pi转运体基因（d5）, betA)和一个报告基因gfp. 利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥,获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥. 可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.